粗莖秦艽種子萌發過程的轉錄組及關鍵因子分析

楊 曉，馬子豪，馬 婕，呂金盈，何 娟，王長生，李愛暖，陳 晨，曾 銳*

粗莖秦艽種子萌發過程的轉錄組及關鍵因子分析

楊 曉?1，馬子豪?1，馬 婕?1，呂金盈?1，何 娟1，王長生?2，李愛暖?1，陳 晨?3*，曾 銳?1*

1. 西南民族大學藥學院，四川 成都 610041 2. 石柱土家族自治縣農業農村委員會，重慶 409100 3. 西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041

研究粗莖秦艽種子萌發的轉錄組信息及影響因子。利用高通量測序技術測定粗莖秦艽種子萌發前、萌發中及萌發后3個階段的轉錄組，并通過生物信息學技術進行分析。共獲得了149 463條Unigenes，平均長度為601.88 bp，其中79 412個Unigene獲得注釋。6943個基因差異表達，大部分表現為萌發后上調表達，其中5188個富集到GO條目中，1815個富集到KEGG通路中，大多參與光反應過程、細胞壁合成、脂質代謝及次生代謝中。單堿基到六堿基核苷酸的SSR重復類型均有檢出，SSR發生頻率為15.13%，出現頻率為18.81%，平均每3199 bp就含有1個SSR位點，SSR重復類型豐富，數目較多。粗莖秦艽種子萌發過程有大量調控基因參與，光照、激素為重要的調控因子，SSR專用標記的開發切實可靠，且為粗莖秦艽的次生代謝調控研究奠定了基礎。

粗莖秦艽；種子；轉錄組；代謝通路；SSR標記；RNA-seq

秦艽性味辛、苦、平，歸胃、肝、膽經，首載于《神農本草經》，列為中品，具祛風濕、清濕熱、止痹痛和退虛熱的功效?[1]，為我國常用的重要藥材。粗莖秦艽Duthie ex Burk.為《中國藥典》2015年版秦艽確定的基原之一，是我國目前栽培量最大的秦艽品種?[2]。近年來臨床用藥量增加，過度采挖導致秦艽野生資源日漸枯竭?[3]，秦艽價格不斷上漲迫切需要開展秦艽規模化人工栽培。粗莖秦艽以有性繁殖為主，其種子自然萌發發芽率低，萌發周期差異大?[4]，導致秦艽繁殖能力低，是困擾人工栽培的重要問題。近年來，主要用過溫水催芽、赤霉素浸種?[5]，CO?2激光處理?[6]，不同芽床?[7]，光照、水分等環境因子?[8]等生理手段研究秦艽種子萌發的機制，其分子機制研究未見報道。

轉錄組為特定細胞或組織在功能狀態或某一發育階段下轉錄出來的所有RNA的集合?[9]。高通量測序技術的迅速發展使得無參考基因組植物基因表達信息的獲得變得越來越簡便、快捷。近年來，轉錄組測序技術（RNA-Seq）越來越多的運用到種子萌發機制的研究中，如在西洋參?[10]、黃芪?[11]等種子萌發機制中的研究。本研究擬通過粗莖秦艽種子萌發前、中、后3個不同時期的轉錄組數據，初步分析粗莖秦艽種子萌發過程的相關基因、途徑以及重要調控因子，為探索秦艽種子萌發的分子機制奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

試驗所用粗莖秦艽種子于2016年采自四川省阿壩州黑水縣沙石多鄉甲足村（102°55′11.95″E，32°7′37.14″N，海拔2710 m）粗莖秦艽種植基地3年生成熟種子，經西南民族大學劉圓教授鑒定為龍膽科植物粗莖秦艽Duthie ex Burk.的成熟種子。

1.2 儀器與試劑

本實驗借助Illumina HiSeq 2000測序平臺，建庫采用illumina原裝試劑盒。1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop 2000（Thermo Fisher公司，美國）檢測RNA的純度，Qubit 2.0（Invitrogen公司，美國）對RNA濃度進行精確定量，Agilent 2100（Agilent公司，美國）精確檢測RNA的完整性，采用Estscan（3.0.3）軟件預測其開放讀碼框，從而得到這部分基因編碼的核酸序列和氨基酸序列，采用Primer3（2.3.5）進行簡單重復序列（simple sequence repeats，SSRs）引物設計。

2 方法

2.1 種子的萌發

選取飽滿種子于12 h光照，恒溫25 ℃下萌發，分別取將萌發前（飽滿的種子，未進行萌發，編號GC-MFQ-01、GC-MFQ-02、GC-MFQ-03）、萌發中（種子萌發至13 d，剛出現露白，編號GC-MFZ-01、GC-MFZ-02、GC-MFZ-03）、萌發后（從露白開始計時，用時5 d，胚根長至0.3～0.5 cm，編號GC-MFH-01、GC-MFH-02、GC-MFH-03）3個階段（圖1）。每個階段取3個生物樣品重復，迅速放入液氮中固定，?80 ℃冰箱儲藏備用。

2.2 RNA抽提及轉錄組測序

樣品總RNA提取按照改良的Trizol的方法進行?[12]，檢測達到測序質量后構建文庫。庫檢合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司Illumina HiSeq?TM2000平臺進行建庫測序。

2.3 轉錄組分析

利用Trinity?[13]對clean reads進行拼接，取每條序列中最長的轉錄本作為Unigene，以此進行后續的分析。基于BLAST?[14]法取值＜1e?5給出Unigene的蛋白數據庫NR注釋、SWISSPROT注釋，蛋白相鄰類的聚簇（KOG）功能注釋、GO（gene ontology）分類和京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路分析。Unigene表達量的計算使用FPKM（fragments Per kb per Million reads）法?[15]。

A-萌發前 B-萌發中 C-萌發后

A為基因名，FPKM(A)為基因A的表達量，為比對到基因A的fragments數，為比對到所有基因的總fragments數，為基因的長度

利用MISA軟件?[16]對粗莖秦艽種子Unigenes進行SSRs檢測，并進行統計分析。

3 結果與分析

3.1 轉錄組質量分析與Unigene拼接、注釋

對粗莖秦艽種子的132 532 476條轉錄組raw data進行過濾，各樣品的clean bases為5.99～6.80 Gb，Q30均在94.71%以上，GC含量平均值為43.71%（表1）。取每條基因中最長的轉錄本為Unigene，共獲得149 463條Unigene，平均長度為601.88 bp，N50為909，長度在1 kb以上的有22 147條，表明組裝結果較可靠。

表1 樣品轉錄組clean data統計

raw data為原始測序序列；clean data為去除接頭、無法確定堿基信息及低質量reads的序列數據；clean bases為測序序列的長度；Q30為堿基正確識別率達99.9%的序列比例；GC含量為堿基G和C占總的堿基數量的百分比

Raw Data was the original sequencing sequence; Clean Data was the sequence data with unconnected base information and low-quality reads; Clean bases was the length of the sequencing sequence; Q30 was the sequence ratio with a correct base recognition rate of 99.9%; GC content was the percentage of bases G and C to the total number of bases.

對獲得的Unigene進行注釋，共有79 412個Unigene獲得注釋信息，約占Unigene總數的53.13%（圖2-B），與NR數據庫比對結果見圖2-A，其中，與咖啡Pierre ex Froehn.的同源性最高，達21.7%，其次為葡萄L. 為5.5%，油菜L. 為5.2%，芝麻L. 為4.3%，煙草L為3.0%，其余物種均小于3%。

圖2 粗莖秦艽轉錄組NR數據庫比對物種分布(A) 及注釋統計 (B)

3.2 粗莖秦艽種子萌發過程中差異表達基因分析

差異基因共6943個。與粗莖秦艽種子未萌發的轉錄組對比，萌發中共有差異基因5960個，萌發后共有差異基因5619個，萌發后與萌發中共有差異基因587個，共同差異基因為386個。對共同差異表達的基因進行聚類分析，大部分差異基因表現為萌發中、萌發后上調表達。差異基因韋恩及聚類分析見圖3。

3.3 差異表達基因的GO和KEGG富集分析

對粗莖秦艽種子萌發過程中的差異基因進行GO分類富集分析，結果表明，共有5188個差異基因富集到GO條目中，其中光合作用、淀粉代謝過程、蔗糖代謝過程為生物過程的優勢富集條目，富集到的差異基因分別占總基因數的1.40%、1.35%和1.35%；光系統II和細胞壁為細胞組分的優勢富集條目，富集到的差異基因分別占總基因數的0.94%和0.83%；CH-OH基團為供體，NAD/NADP為受體的氧化還原酶活性和醇類為受體的磷酸酶活性為分子功能的優勢富集條目，富集到的差異基因分別占總基因數的17.15%和15.42%（圖4）。對粗莖秦艽種子萌發過程中的差異基因進行KEGG富集分析，結果表明，共有1815個差異基因富集到KEGG通路中，其中淀粉和蔗糖的代謝（參與該通路的差異基因占比為5.29%）、植物激素信號轉導（4.41%）、苯丙素類的生物合成（3.97%）、氨糖和核糖代謝（3.53%）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（2.81%）、光合作用的碳固定（2.75%）、脂肪酸代謝（2.70%）、戊糖-葡萄糖醛酸轉換（2.37%）、光合作用（2.26%）和萜類化合物骨架的生物合成（1.82%）為KEGG富集途徑的Top10（圖5）。

圖3 差異基因維恩(A)及聚類分析(B)

圖4 差異基因的GO富集分析

圖5 差異KEGG富集(top20)

3.4 種子萌發的差異代謝及調控過程分析

粗莖秦艽為環烯醚萜類、黃酮類等次生代謝產物含量豐富的藥用植物，因此，對粗莖秦艽種子萌發過程中的代謝過程進行轉錄分析。較多的差異基因參與光反應過程、細胞壁合成、脂質代謝及次生代謝中（圖6）。植物通過感受外界及自身的信號調控自身的發育，秦艽種子萌發過程中參與赤霉素、生長素、細胞分裂素等調控過程的差異基因數目較多，同時，大量的轉錄因子也參與了種子萌發過程的調控。通過以上統計分析，光照條件為秦艽種子萌發重要的外界條件，赤霉素、生長素、細胞分裂素等通過單獨或聯合調控萌發。

種子萌發過程中，含氮化合物、異戊二烯類、黃酮類等次生代謝過程中基因表達差異，統計結果見表2。轉錄因子調控著基因的表達，大量的轉錄因子在種子萌發過程中差異表達，統計發現，Auxin Response Factor家族、bHLH家族、Constans-like zinc finger家族、MYB-domain家族、WRKY家族、Aux/IAA家族、bZIP家族、NAC-domain家族為差異基因數目較多的轉錄因子家族，結果見表3。

A-差異代謝富集 B-差異調控富集

表2 粗莖秦艽種子萌發過程次生代謝差異基因統計

3.5 SSRs特征分析

利用軟件MISA對粗莖秦艽轉錄組149 463條Unigene序列進行SSR位點分析，單堿基到六堿基核苷酸重復類型均有檢出。其中，28 120個SSR分布于22 613條Unigene序列中，SSR發生頻率（含有SSR的Unigene數目與總Unigene的數目之比）為15.13%，出現頻率（檢出SSR個數與總Unigene數目之比）為18.81%，平均每3199 bp就含有1個SSR位點（圖7）。其中18 167條Unigenes只包含單個SSR位點，4446條Unigenes包含1個以上SSR位點。粗莖秦艽SSR重復類型豐富，數目較多。

從SSR位點數量上看，出現最多的為一至三核苷酸重復，占到總SSR位點數量的98.45%。其中單核苷酸重復比例最高，可占到62.42%，A/T為優勢重復類型，占單核苷酸重復類型的95.66%；其次為三核苷酸和雙核苷酸重復，分別為19.46%和16.59%，AAG/GAA為三核苷酸優勢重復類型，占三核苷酸重復類型的7.78%，AT/TA為二核苷酸優勢重復類型，占二核苷酸重復類型的54.91%。四、五、六核苷酸重復類型的數量很少，總計占比1.55%（表4）。

表3 粗莖秦艽種子萌發過程差異轉錄因子統計

圖7 粗莖秦艽種子轉錄組SSR重復類型統計

4 討論

4.1 秦艽有效成分合成基因的篩選

粗莖秦艽的主要活性成分有環烯醚萜類、黃酮類、萜類及苯丙素類等[17-19]，對粗莖秦艽種子萌發過程的轉錄組進行統計發現，大量的次生代謝相關基因差異表達，包括含氮化合物、異戊二烯類、黃酮類等，與陳俊可等?[18]、王長生等[19]對于粗莖秦艽有效成分的鑒定結果一致。因此，在后續研究中，應對該部分基因進行克隆及功能驗證，以期解析粗莖秦艽有效成分的基因合成路徑，為粗莖秦艽有效成分的生物合成奠定基礎。

表4 粗莖秦艽種子轉錄組的SSR位點分析

4.2 秦艽種子萌發水平的機制初探

植物激素是一類調節植物生理反應的活性物質?[20]。赤霉素?[21]、脫落酸?[22]、乙烯?[20]均可參與種子休眠的調控；生長素促進細胞的分裂與分化?[23]；細胞分裂素可調控芽的形成?[24]。統計粗莖秦艽種子萌發過程差異表達基因，大量的生長素、赤霉素調控基因差異表達，因此，生長素、赤霉素在粗莖秦艽種子萌發過程中起重要作用。與侯格平等?[5]使用了赤霉素浸種秦艽種子，提高了其萌發率相符合。另外，光反應過程、碳固定、淀粉和蔗糖代謝相關基因大量差異表達，表明光照應為粗莖秦艽種子萌發的重要條件。因此，后續試驗應繼續驗證光照、植物內源激素對秦艽種子萌發的調控功效，以期提高粗莖秦艽種子萌發水平。

4.3 秦艽專屬SSR標記的開發

SSR標記因其可重復性、多等位性、共顯性遺傳、相對豐度和良好的基因組覆蓋率等特點，在植物遺傳育種中廣泛的應用?[25]。利用轉錄組開發的SSR標記均位于編碼區，因此，更有效地解釋了不同品種的表型和功能的多樣性，目前厚樸?[26]、云錦杜鵑?[27]等已利用轉錄組成功開發出有效的SSR標記。分析粗莖秦艽轉錄組的SSR特征，表明SSR類型豐富、數量可觀，為粗莖秦艽遺傳多樣性研究及分子育種提供研究基礎。

綜上，研究粗莖秦艽種子萌發過程的轉錄組學，獲得了大量的重要信息，后續將通過驗證各個因子對于粗莖秦艽種子萌發的影響，揭示粗莖秦艽種子萌發的機制，探索提高其萌發率及成活率的技術手段。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Transcriptome and key factors analysis ofin seed germination process

YANG Xiao?1, MA Zi-hao?1, MA Jie?1, LYU Jin-ying?1, HE Juan?1, WANG Chang-sheng?2, LI Ai-nuan1, CHEN Chen3, ZENG Rui?1

1. School of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China 2. Shizhu Tujia Autonomous County Agriculture and Rural Committee, Chongqing 409100, China 3. Institute of Qinghai-tibetan Plateau, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China

To explore the transcriptome information and key factors ofin seed germination process.The transcriptome of the stage before germination, during germination and after germination ofwere determined by high-throughput sequencing and analyzed by systemic bioinformatics.A total of 149 463 unigenes were obtained, with an average length of 601.88 bp, and 79 412 unigenes were successfully annotated. A total of 6943 genes were differentially expressed, most of which were up-regulated after germination. Among them, 5188 genes were enriched in the GO and 1815 genes were enriched in the KEGG pathway, most of which were involved in the light reaction, cell wall synthesis, lipid metabolism and secondary metabolism. The 1—6 nucleotides SSR repeat types were all detected. The frequency of SSR occurrence was 15.13% and the frequency of appearing was 18.81%. On average, every 3199 bp contained one SSR site. Abundant SSR repeat types and a large number of SSR repeat types were obtained.A large number of genes were involved in regulating the germination process of. Light and plant hormones were important regulatory factors. The special SSR markers development was effective and reliable through transcriptome information. This study provided a reference for further understanding of regulation ofsecondary metabolism.

Duthie ex Burk.; seeds; transcriptome; metabolim pathway; SSR markers; RNA-seq

R282.12

A

0253 - 2670(2021)01 - 0219 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.026

2020-06-06

國家重點研發計劃（2017YFC1700705）；四川省留學人員科技活動項目擇優資助經費計劃（2018-68）；四川省重點研發項目（2019YFS0174）；四川省科技支撐項目（14ZC2103）；西南民族大學研究生創新型科研項目（CX2020SZ77）

楊 曉（1997—），碩士研究生，主要從事中藥資源研究。Tel: 13258279138 E-mail: xiaoyeeyang@yeah.net

陳 晨（1987—），助理研究員，博士，主要從事藥用植物發育分子機理及民族藥資源研究。Tel: (028)83372832 E-mail: lilychenqhu@163.com

曾 銳（1976—），教授，主要從事中藥和民族藥研究。Tel: (028)85522099 E-mail: rzeng@swun.edu.cn

[責任編輯 時圣明]