基于Wnt/β-catenin信號通路探討VEGF基因轉染骨髓源內皮祖細胞移植治療大鼠缺血皮瓣的實驗

殷杰 趙勝利 蔡曉明 袁輝宗 李俊杰 竺楓

[摘要] 目的 分析基于無翅型MMTV整合位點家族（Wnt）/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路，血管內皮生長因子（VEGF）基因轉染骨髓源內皮祖細胞（EPCs）移植對大鼠缺血皮瓣的治療作用。 方法 培養誘導分化大鼠EPCs，脂質體介導VEGF轉染EPCs。Wistar大鼠制備缺血皮瓣模型分為對照組、VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、Wnt/β-catenin信號通路激活劑氯化鋰（LiCl）組。VEGF-EPCs組與NC-EPCs組皮瓣分別注射PcDNA3.1（+）/VEGF165質粒、PcDNA3.1（+）/NC空載對照質粒，對照組注射PBS溶液，LiCl組注射LiCl。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清VEGF水平;觀察大鼠皮瓣存活情況;激光多普勒血液檢測儀檢測皮瓣蒂部血流;HE染色計算皮瓣毛細血管密度;Western blotting檢測皮瓣組織Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達。 結果 鏡下觀察分離培養的EPCs外觀呈“鋪路石”狀，經鑒定符合EPCs表面抗原。VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、LiCl組血清VEGF水平、皮瓣存活率、PU值、毛細血管密度高于對照組，且VEGF-EPCs組高于NC-EPCs組、LiCl組，差異有統計學意義（P<0.05），NC-EPCs組與LiCl組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、LiCl組β-catenin、c-myc蛋白相對表達量高于對照組，LiCl組高于VEGF-EPCs組與NC-EPCs組，VEGF-EPCs組高于NC-EPCs組，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 VEGF基因轉染骨髓源EPCs移植能促進大鼠缺血皮瓣的存活，改善血液循環，增加微血管密度，其機制與Wnt/β-catenin信號通路的激活有關。

[關鍵詞] 血管內皮生長因子;皮瓣移植;無翅型MMTV整合位點家族;β-連環蛋白;內皮祖細胞

[中圖分類號] R622? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）31-0036-05

[Abstract] Objective To analyze the therapeutic effects of vascular endothelial growth factor （VEGF） gene transfection of bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs） transplantation on ischemic flaps in rats based on the wingless-type mouse mammary tumor virus （MMTV） integration site family （Wnt）/β-catenin signaling pathway. Methods The rat EPCs were cultured and induced to differentiate， and the EPCs were transfected with liposome-mediated VEGF. The Wistar rats were divided into control， VEGF-EPCs， negative control （NC）-EPCs and Wnt/β-catenin signaling pathway activator lithium chloride（LiCl） groups to prepare the ischemic flap models. These Wistar rats in the VEGF-EPCs group， NC-EPCs group， control group and LiCl group were respectively injected with PcDNA3.1（+）/VEGF165 plasmid， PcDNA3.1（+）/NC empty control plasmid， phosphate buffer saline （PBS） solution and LiCl into the skin flaps. Serum VEGF levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， the survival of rat flaps was observed， blood flow at the tip of the flap was measured by laser Doppler blood detector， HE staining was performed to calculate the capillary density of flap， and Western blotting was adopted to detect the expression of proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway in flap tissue. Results The appearance of EPCs was “paving stone” under microscope， which was identified as meeting the surface antigen of EPCs. Serum VEGF levels， flap survival rate， PU value， and capillary density in the VEGF-EPCs group， NC-EPCs group， and LiCl group were higher than those of the control group， and those of the VEGF-EPCs group were higher than those of the NC-EPCs group and LiCl group，the difference was statistically significant（P<0.05）. However，there were no significant differences between the NC-EPCs group and the LiCl group in the above-mentioned indices （P>0.05）. The relative expression of β-catenin and c-myc protein in the VEGF-EPCs group， NC-EPCs group and LiCl group was higher than that in the control group. Meanwhile，the relative expression of β-catenin and c-myc protein in the LiCl group was higher than that in the VEGF-EPCs group and NC-EPCs group， and that in the VEGF-EPCs group was higher than that in the NC-EPCs group，the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion VEGF gene transfection of bone marrow-derived EPCs transplantation can promote the survival of ischemic flaps， improve blood circulation and increase microvascular density in rats， and the mechanism is related to the activation of Wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words] Vascular endothelial growth factor; Flap transplantation; Wingless-type MMTV integration site family; β-catenin; Endothelial progenitor cells

皮瓣移植是治療軟組織缺損的有效方式，在肌腱、大血管、神經干、關節、骨等組織裸露的新鮮創面/陳舊性創傷和器官再造中均有應用[1]。移植部位皮瓣血管的新生與血運重建是影響皮瓣存活的關鍵，干細胞治療技術的發展，為血運重建的治療研究提供了新的方向[2]。血管內皮組細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）作為血管內皮細胞的前體細胞，能在一定的生理或病理條件刺激下，從骨髓動員至外周血，參與損傷血管的修復與再生[3]。研究證實[4]，缺血肢體中植入EPCs，可改善血運，證實了EPCs移植治療的可行性。但在糖尿病、老年人及高膽固醇血癥人群中，因血液循環中EPCs少，應用有限。血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是調控EPCs向內皮分化的重要細胞因子，在促進EPCs的分裂、增殖、遷移與血管構建方面有強大的調控作用[5]。故本研究探討VEGF基因轉染骨髓源EPCs移植對缺血皮瓣大鼠模型的治療情況及無翅型MMTV整合位點家族（Wingless-type MMTV integration site family，Wnt）/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路在其中的調控作用，以期為皮瓣移植及相關缺血性疾病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，45只，4周齡，體重60～90 g，購自廣州賽業百沐生物科技有限公司，許可證號SCXK（粵）2020-0055。任選40只大鼠隨機分為對照組、VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、Wnt/β-catenin信號通路激活劑氯化鋰（LiCl）組，每組10只。

1.2 藥物、試劑與儀器

PcDNA3.1（+）/VEGF165質粒、PcDNA3.1（+）/NC空載對照質粒（上海生工生物工程有限公司構建合成），LiCl（含量≥98%，美國HARVEY公司），兔抗鼠CD34+、CD133+、血管內皮細胞生長因子受體-2（VEGFR-2+）、β-catenin、反式激活活性蛋白（cell-myc，c-myc）一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（德國默克公司），脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000[貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司]，酶聯免疫吸附實驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）VEGF試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司），CheniDoc XRS化學發光成像分析系統（美國Bio-rad公司），PeriFlux 5000激光多普勒血液檢測儀（帕瑞醫學科技有限公司），M500熒光顯微鏡（賽默飛世爾科技中國有限公司），Attune NxT流式細胞儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 EPCs分離培養及鑒定? 任選5只Wistar大鼠，2%戊巴比妥鈉過量麻醉處死（100 mg/kg），75%酒精浸泡10 min，于無菌工作臺取四肢長骨，放置于含有10 mL PBS的平皿中，剪骨刀沿長骨中間剪開，PBS溶液沖洗骨髓腔，獲得骨髓細胞反復吹打均勻，250目濾網過濾，1000 r/min離心5 min，收集底部細胞，加入Histopaque-1083細胞分離液，2000 r/min離心30 min，吸取第二層單核細胞，PBS清洗、吹打混勻，1000 r/min離心10 min，棄上清，調整細胞濃度為107/mL接種于鋪有纖維連接蛋白的塑料培養皿中，37℃，5%CO2環境培養箱中培養，每3～4 天換液1次，待細胞生長融合至80%時，以0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸二鈉消化，1∶2比例傳代分瓶。取第2代晚期EPCs，胰酶消化后PBS重懸，調整細胞密度為1×106個/mL，分成每管100 μL，加入CD34+、CD133+、VEGFR-2+兔抗鼠單克隆抗體，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌后重懸細胞，以流式細胞技術鑒定細胞免疫表型。

1.3.2 PcDNA3.1（+）/VEGF165體外轉染EPCs? 培養第7 天，細胞融合率達到70%左右，EPCs以1.0×107/L密度接種于24孔板中，每孔5個復孔，分別設為對照組、VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、LiCl組，其中VEGF-EPCs組與NC-EPCs組嚴格按照Lipofectamine TM2000脂質體法轉染說明書要求轉染PcDNA3.1（+）/VEGF 165質粒、PcDNA3.1（+）/NC空載對照質粒，對照組不轉染任何質粒，LiCl組加入40 μM的LiCl。

1.3.3 缺血皮瓣制備及細胞移植? 根據參考文獻[6-7]制備缺血皮瓣模型，2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，取俯臥位固定，備皮消毒，于背部設計蒂部位于雙側髂棘連線上的隨意型超比例皮瓣，造成遠端部分組織缺血，大小約為2 cm×8 cm，沿標記線切開皮瓣四邊達深筋膜。在皮瓣形成后分別于距離皮瓣蒂部4.5、6、7.5 cm，距皮瓣邊緣各1 cm的深筋膜層選擇6個對稱注射部位點，VEGF-EPCs組注射含有5×105個VEGF-EPCs的PBS 500 μL，NC-EPCs組注射5×105個NC-EPCs的PBS 500 μL，對照組僅予以注射PBS 500 μL，LiCl組注射含有LiCl的PBS 500 μL，注射后以3-0尼龍線將皮瓣原位縫合，分籠飼養，于術后4 d斷蒂。

1.3.4 ELISA檢測血清VEGF水平? 于斷蒂后7 d（皮瓣術后11 d）后抽取尾靜脈血，離心分離上層血清，保存于-20℃環境，按照ELISA試劑盒說明書檢測VEGF水平，以酶標儀讀取450 nm處吸光度值，根據標準曲線計算各組VEGF水平。

1.3.5 皮瓣存活率、皮瓣供血及毛細血管密度檢測? 尾靜脈抽血后麻醉固定大鼠，背部皮瓣拍照，以Image-Pro Plus軟件分析皮瓣存活率。皮瓣存活率=（皮瓣總面積-皮瓣壞死面積）/皮瓣總面積×100%，皮瓣壞死判斷標準：顏色發黑、質地較硬，有組織回縮表現，或有壞死創面形成。以激光多普勒血液檢測儀檢測皮瓣蒂部血流灌注，記錄PU值（灌注單位）。PU值檢測后切取皮瓣標本，10%中性甲醛固定，酒精梯度脫水，常規石蠟包埋，制作4 μm厚度切片，HE染色，中性樹膠封片，隨機選5個視野，計算視野中毛細血管密度（血管斷面數目/面積）。

1.3.6 Western blotting檢測Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達情況? 剩余皮瓣液氮中研磨，Trizol試劑盒提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA，細胞裂解液裂解后，離心取上層清液，BCA試劑盒鑒定蛋白總量，取適量蛋白樣品加入等體積上樣緩沖液，100℃水浴加熱5 min使蛋白變性，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，轉膜，37℃、5%脫脂奶粉封閉孵育1 h，加入β-catenin（1∶500）、c-myc（1∶800）一抗稀釋液，4℃孵育過夜，加入二抗稀釋液（1∶2000），常規孵育30 min，ECL顯影、定影，凝膠成像系統掃描分析灰度值析，以目的蛋白與GAPDH內參灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件分析處理數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPCs形態觀察及鑒定

分選后的細胞24 h內貼壁生長，形態為圓形或類圓形，培養第3～10 天可見EPCs克隆，集落中心細胞密度較高，細胞呈梭形、三角形或多邊形;傳代后3 d低倍鏡下見細胞呈“鋪路石”樣外觀（封三圖3）。流式細胞儀鑒定晚期EPCs表達CD34+、CD133+、VEGFR-2+，陽性細胞比率分別為（13.52±1.23）%、（1.23±0.23）%、（38.58±4.36），符合EPCs表面抗原。

2.2 各組大鼠血清VEGF水平比較

各組大鼠血清VEGF水平比較，差異有統計學意義（P<0.001）;與對照組比較，VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、LiCl組血清VEGF水平更高（P<0.05）;與VEGF-EPCs組比較，NC-EPCs組與LiCl組血清VEGF水平更低（P<0.05）;NC-EPCs組與LiCl組血清VEGF水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠皮瓣存活率、PU值及毛細血管密度比較

各組大鼠皮瓣存活率、PU值、毛細血管密度比較，差異有統計學意義（P<0.001）;與對照組比較，VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、LiCl組大鼠皮瓣存活率、PU值及毛細血管密度更高（P<0.05）;與VEGF-EPCs組比較，NC-EPCs組與LiCl組皮瓣存活率、PU值及毛細血管密度更低（P<0.05）;NC-EPCs組與LiCl組皮瓣存活率、PU值及毛細血管密度比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠皮瓣組織β-catenin、c-myc蛋白表達比較

各組大鼠皮瓣組織β-catenin、c-myc蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.001）;與對照組比較，VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、LiCl組的β-catenin、c-myc蛋白相對表達量更高（P<0.05）;與VEGF-EPCs組比較，NC-EPCs組β-catenin、c-myc蛋白相對表達量更低，LiCl組β-catenin、c-myc蛋白相對表達量更高（P<0.05）;與NC-EPCs組比較，LiCl組β-catenin、c-myc蛋白對表達量更高（P<0.05）。見表3、圖1。

3 討論

近年來，隨著社會生活節奏的加快，車禍、重物砸傷引起的軟組織缺損及各種心血管并發癥造成的器官及肢體遠端缺血病例增加，常規保守治療難以達到滿意的效果，需皮瓣移植治療[8]。及時的血運重建是皮瓣移植再植存活的基本條件，血管的新生是再植皮瓣血運重建的關鍵，涉及血管形成和血管生成兩種機制[9]。EPCs移植是目前治療性血管生成技術的重要研究內容，而VEGF作為調控EPCs分化的細胞因子，在促進血管形成方面有重要作用。本研究通過驗證VEGF基因體外轉染骨髓源EPCs移植治療缺血皮瓣大鼠模型，觀察其皮瓣存活情況，并探討相關機制，旨在為組織及器官缺血的研究提供參考。

利用組織工程與基因技術促進血管新生的細胞因子植入損傷部位，以促進局部血管再生和血運重建，達到組織修復的目的是皮瓣移植治療的目的。EPCs是近年來干細胞治療技術中研究較多的細胞類型，具有多向分化潛能，在骨髓、胚胎組織、脂肪組織及臍帶血中廣泛存在，其中骨髓中的含量最為豐富，增殖能力更強且獲取方便[10-11]。EPCs在組織缺血時能從骨髓中動員遷移至缺血部位，分化為成熟的內皮細胞，促進新生血管的形成，且被證實對于促進慢性傷口組織再生有極大的潛能[12-13]。雖然以EPCs為主的干細胞治療技術具有多種優勢，但在老年人、糖尿病等骨髓造血能力較弱人群中，其循環中的EPCs缺乏，無法滿足治療需要，如何使能力有限的EPCs獲得更好的促血管生成作用成為學者們的研究重點。VEGF是一種糖基化分泌性多肽因子，可由內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、骨骼肌細胞及成纖維細胞分泌，參與胚胎時期的心血管系統形成，促進內皮細胞的增殖、遷移，增加血管的通透性并能調整血管密度，其中VEGF165是其主要表型[14-15]。本研究中通過脂質體介導，將VEGF165基因轉染至誘導分化成功的EPCs，注射于大鼠缺血皮瓣，結果VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、LiCl組血清VEGF水平、皮瓣存活率、PU值、毛細血管密度高于對照組，且VEGF-EPCs組高于NC-EPCs組、LiCl組，NC-EPCs組與LiCl組比較，差異無統計學意義（P>0.05），說明VEGF基因轉染骨髓源EPCs移植與Wnt/β-catenin信號通路的激活均可促進大鼠缺血皮瓣血管形成和血管生成，更利于缺血皮瓣的存活。

Wnt/β-catenin信號通路是生物體進化過程中高度保守的通路，在調控細胞的增殖、生長、分化、維持細胞內環境穩定中有重要作用，參與缺血周邊組織血管的新生[16]。研究發現[17]，多功能干細胞向內皮細胞分化依賴于β-catenin介導的Wnt/β-catenin信號通路的調控作用。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的關鍵調控蛋白，在無小分子Wnt配體的情況下，胞質內β-catenin被磷酸化降解，導致細胞質內游離的β-catenin水平下降，在缺血缺氧條件下機體受Wnt信號刺激，Wnt/β-catenin通路被激活，促進散亂蛋白磷酸化，抑制β-catenin的磷酸化，使非磷酸化的β-catenin在細胞質內堆積易位進入細胞核，促進其下游靶基因c-mys的表達[18]。研究發現[19]，Wnt/β-catenin能與VEGF基因啟動子中TCF位點結合，參與VEGF基因的轉錄、調控。Jiang等[20]發現，在小鼠四肢缺血模型中通過破壞β-catenin與細胞因子之間的相互作用，可抑制缺血性損傷后的血管生成，并損害Wnt/β-catenin信號的傳導。本研究結果中VEGF-EPCs組、NC-EPCs組、LiCl組β-catenin、c-myc蛋白相對表達量高于對照組，LiCl組高于VEGF-EPCs組與NC-EPCs組，VEGF-EPCs組高于NC-EPCs組，說明VEGF基因轉染骨髓源EPCs能提高缺血皮瓣組織中Wnt/β-catenin信號通路蛋白的表達。

綜上所述，VEGF基因轉骨髓源EPCs移植治療大鼠缺血皮瓣能促進皮瓣存活，改善皮瓣供血，促進毛細血管的生成，其機制可能與Wnt/β-catenin信號通路的調控有關。可考慮將VEGF基因轉染骨髓源移植作為皮瓣移植治療的研究方向。

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（收稿日期：2021-03-04）