銅離子對花鰍急性毒性研究

趙云龍，李琳琪，喬淑芬，張東鳴，張宇柔

（1.通化師范學(xué)院，吉林 通化 134000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118）

花鰍Cobitis taenia 屬鯉形目鰍科，為一種多年生小型淡水冷水魚。花鰍味道鮮美、肉質(zhì)緊致細(xì)膩，脂肪含量高，香味突出，營養(yǎng)和藥用價(jià)值很高，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)潛力。花鰍主要生活在砂石底、清澈的流水環(huán)境中，對水質(zhì)條件要求高。

銅作為生物必需微量元素之一，參與魚類體內(nèi)多種物質(zhì)代謝，對造血、生長、繁殖等具有重要作用，適量的銅離子有利于水產(chǎn)動物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[1]。過量銅離子會導(dǎo)致水產(chǎn)動物機(jī)體結(jié)構(gòu)和生理功能異常，發(fā)生各種病變和疾病；魚類的抗氧化系統(tǒng)也會受到傷害，并具有一定的遺傳毒性[2,3]。

銅離子是河流中常見的重金屬之一，魚類通過呼吸和取食等活動攝入體內(nèi)。銅離子對魚類的急性毒性研究很多，而冷水條件下，銅離子對花鰍的急性毒性卻尚未見報(bào)道。本研究采用靜水生物測試法研究了銅離子對花鰍的急性毒性，評價(jià)了銅離子對花鰍的安全性，可為花鰍生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有利于花鰍養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用水為全自動逆滲透純水機(jī)處理的純凈水，pH6.8～7.2，水溫（15±1）℃。實(shí)驗(yàn)用魚為野生花鰍，2018 年5 月中旬采自通化市向陽村（E 126.033449°，N 41.691667°）河流中，使用0.1%高錳酸鉀溶液消毒后，于通化師范學(xué)院冷水魚養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)池中暫養(yǎng)7 d。隨機(jī)選取540 尾健康、無傷病，體長（90±20）mm，體質(zhì)量（4.1±0.6）g 個體，隨機(jī)分為6 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)30 尾。實(shí)驗(yàn)容器為75 cm×60 cm×50 cm 的聚乙烯塑料水族箱，每箱盛放藥液容量180 L。

1.2 方法

中毒癥狀觀察及LC50測定：采用靜水法生物測試[4,5]，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用等對數(shù)間距法設(shè)置5 個濃度組：0.10 mg/L、0.17 mg/L、0.30 mg/L、0.51 mg/L和0.90 mg/L，對照組0 mg/L，重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)所用硫酸銅（CuSO4·5H2O）為分析純（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）。實(shí)驗(yàn)期間不投喂，不充氣。實(shí)驗(yàn)中每8 h 觀察觀察花鰍的行為、中毒癥狀、死亡等情況，記錄24 h、48 h、72 h 和96 h 的存活情況，采用線性回歸法求出LC50，安全濃度=96hLC50×0.1。

銅離子含量測定：實(shí)驗(yàn)24 h 時，分別從各組中隨機(jī)取3 尾花鰍，經(jīng)MS-222 麻醉后，用超純水將體表沖洗干凈，解剖取其鰓和肝臟，用超純水清洗，再用濾紙吸干，樣品在105℃烘箱中干燥24 h 至恒重待用[6]。銅離子含量參照《食品中銅的測定》方法[7]，使用石墨爐原子光譜吸收儀（4510F，上海儀電）檢測。

酶活性測定：實(shí)驗(yàn)24 h 時，各濃度組和對照組分別隨機(jī)取3 尾花鰍，快速解剖取出腦、肝臟，稱取適量的樣品，按質(zhì)量∶體積=1∶10 加入4℃預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴下，用JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行勻漿。勻漿液在4℃下4 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清液備用。采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定蛋白質(zhì)含量，POD（過氧化物酶，U/mgprot）、GDH（谷氨酸脫氫酶，U/mgprot） 活性和Glu （谷氨酸，μmol/gprot）濃度測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，按說明書測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 花鰍在銅離子下的癥狀變化及LC50 測定

花鰍在不同濃度銅離子溶液中反應(yīng)不同：低濃度出現(xiàn)中毒的癥狀比高濃度晚。剛投入含銅離子的水中，低濃度組的花鰍與對照組無明顯差別；3 h時，高濃度組（0.51 mg/L、0.90 mg/L）的花鰍局促不安、急劇游動，有時在水中側(cè)翻、打轉(zhuǎn)；9 h 時，高濃度組（0.51 mg/L、0.90 mg/L）的花鰍游動速度減慢，反應(yīng)遲緩，逐漸失去運(yùn)動能力，躺臥在水族箱底部，出現(xiàn)死亡。中毒初期，花鰍體色稍變淺，體表黏液較少，隨著中毒時間延長，體表分泌黏液逐漸增多。72 h 時，最高濃度組（0.90 mg/L）花鰍全部中毒死亡，胸鰭充血，口張開，身體側(cè)翻，鰭條均下垂。低濃度組（0.17 mg/L、0.30 mg/L）花鰍在脅迫24 h 時出現(xiàn)中毒癥狀，一旦中毒，癥狀基本相同。最高濃度組（0.90 mg/L）脅迫3 h 后，出現(xiàn)輕微的中毒癥狀，9 h 出現(xiàn)死亡，24 h 死亡率達(dá)（81.67±2.05）%（表1）。24 h 內(nèi)0.51 mg/L 組接近半數(shù)死亡，其他低濃度組（0.10 mg/L、0.17 mg/L、0.30 mg/L）未出現(xiàn)死亡。隨著銅離子濃度的遞增，其毒性逐漸加大，花鰍死亡率上升；銅離子對花鰍的24 h、48 h、72 h 和96 h LC50分別為0.6040 mg/L、0.5148 mg/L、0.3812 mg/L 和0.298 mg/L，安全質(zhì)量濃度為0.02398 mg/L（表2）。

表1 花鰍在不同銅離子濃度的死亡率Tab.1 Mortality of spined loach C.taenia exposed to different Cu2+concentrations

表2 銅離子對花鰍的急性毒性的線性回歸方程、LC50 及安全濃度Tab.2 The linear regression equation,LC50 and safe concentration of Cu2+to pined loach

2.2 花鰍肝臟及鰓中銅離子含量變化

隨著水中銅離子濃度的增加，肝臟和鰓中銅離子的濃度也增加，且肝臟中的銅離子濃度小于鰓中的銅離子濃度（圖1）；24 h 時肝臟中高濃度組（0.17 mg/L、0.30 mg/L、0.51 mg/L 和0.90 mg/L）與對照組差異顯著（P＜0.05），而鰓中0.30 mg/L、0.51 mg/L 和0.90 mg/L 組與對照組差異顯著（P＜0.05）。

2.3 花鰍在不同濃度的銅離子溶液中24h 時POD、GDH 活性和Glu 濃度變化

由圖2 可知：銅離子脅迫24 h 時，花鰍肝臟中POD 和GDH 活性隨銅離子濃度的增大而上升，不同濃度組間存在顯著差異，且最高濃度組（0.9 mg/L）的活性最大。花鰍腦中Glu 濃度隨水體中銅離子濃度增加呈相同趨勢（圖3），不同濃度組間亦存在顯著差異，最高濃度組（0.9 mg/L）的濃度最大。

3 討論

3.1 銅離子對花鰍毒性

花鰍Cu2+中毒癥狀為局促不安、急劇游動，水中側(cè)翻、打轉(zhuǎn)，游動速度減慢，反應(yīng)遲緩，失去運(yùn)動能力，躺臥在水族箱底部；花鰍中毒初期，肉眼可見體色稍變淺，體表黏液較少，但隨著中毒時間延長，分泌黏液逐漸增多，與中華鱘Acipenser sinensis 幼魚[8]、中國花鱸Lateolabrax maculatus 幼魚[9]、中華倒刺鲃Spinibarbus sinensis 幼魚[10]、細(xì)鱗鮭Brachymystax lenok 幼魚[11]、泥鰍Misgurnus anguillicaudatus[12]、金 魚Carassius auratus[13]、黃河鯉Cyprinus carpio[14]和錦鯉Cyprinus carpio[15]的急性毒性實(shí)驗(yàn)的表現(xiàn)癥狀基本一致。銅離子濃度影響了花鰍體表黏液蛋白組分及含量，而黏液細(xì)胞在一定限度內(nèi)對外界的銅離子脅迫具有保護(hù)性反應(yīng)作用，但當(dāng)超過其最大限度時，黏液細(xì)胞將遭到破壞，失去其生物活性功能。

3.2 銅離子對花鰍的致死效應(yīng)及安全濃度評價(jià)

根據(jù)危險(xiǎn)化學(xué)品魚類急性毒性分級實(shí)驗(yàn)方法（GBT 21281-2007）[16]，銅脅迫96 h，花鰍的安全濃度為0.02398 mg/L，毒性分級為急性Ⅰ，銅對花鰍是劇毒物質(zhì)，花鰍對水體銅污染敏感。已有研究表明：銅離子毒性受到水環(huán)境的理化因素、被檢測水生生物的種類、規(guī)格、生長等多種因素影響，如天然水體中有機(jī)質(zhì)、懸浮物、鈣離子和鎂離子等多種物質(zhì)都能降低硫酸銅的毒性，提高銅離子的安全濃度。本實(shí)驗(yàn)中，銅離子對花鰍的半致死濃度和安全濃度是在銅離子單獨(dú)作用下的結(jié)果，對養(yǎng)殖具有一定參考價(jià)值，但在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中仍需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行具體分析和處理。

3.3 銅離子對花鰍鰓、肝臟、POD、GDH 和Glu 的影響

鰓是花鰍氣體交換的主要場所，由磷脂組成的鰓膜能直接吸附游離銅離子[17]。肝是魚類是富集和解毒重金屬的主要場所[18]，故本實(shí)驗(yàn)選取鰓和肝臟檢測銅離子含量，發(fā)現(xiàn)花鰍鰓和肝臟銅離子濃度與水中銅離子濃度直接相關(guān)。銅離子脅迫會降低肝臟中酶的活性、增加脂質(zhì)過氧化作用，引起脂肪肝[19]；損傷神經(jīng)系統(tǒng)，造成腦機(jī)能障礙，尤其是小腦機(jī)能的障礙，使中毒魚失去平衡[20]，故本實(shí)驗(yàn)選取肝臟中POD、GDH 活性和腦中Glu 濃度進(jìn)行研究。

POD 是一種氧化還原酶，具有使毒性物質(zhì)失活、調(diào)節(jié)氧濃度的作用，可分解細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物，減少細(xì)胞內(nèi)過氧化物的積累，有助于緩解重金屬離子脅迫的傷害[13,21]。當(dāng)花鰍受銅離子脅迫時，產(chǎn)生大量的自由基，攻擊細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，肝臟中的POD 活性上升，以期修復(fù)銅離子對花鰍肝臟組織的損傷。

谷氨酸脫氫酶（GDH）在肝細(xì)胞中含量最為豐富，是肝線粒體特異性酶，還與轉(zhuǎn)氨酶聯(lián)合參與完成肝臟氨基酸分解代謝，可作為肝臟損傷程度及急性肝壞死的判斷指標(biāo)[22]，即肝臟重度損傷時肝細(xì)胞中的線粒體酶，如GDH 會被釋放出來。肝臟中的GDH 活性呈上升趨勢，表明銅離子對花鰍肝臟組織的損傷越來越嚴(yán)重。

Glu 作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，分泌過多會導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。花鰍腦中的Glu 濃度上升，Glu 的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)會發(fā)生障礙，引起Glu 堆積，而突觸間隙中的Glu 的大量堆積會導(dǎo)致神經(jīng)元的毒性作用，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的凋亡或壞死，造成腦損傷。