銅離子對花鰍急性毒性研究

趙云龍，李琳琪，喬淑芬，張東鳴，張宇柔

（1.通化師范學院，吉林 通化 134000；2.吉林農業大學，吉林 長春 130118）

花鰍Cobitis taenia 屬鯉形目鰍科，為一種多年生小型淡水冷水魚。花鰍味道鮮美、肉質緊致細膩，脂肪含量高，香味突出，營養和藥用價值很高，具有較高的經濟價值和開發潛力。花鰍主要生活在砂石底、清澈的流水環境中，對水質條件要求高。

銅作為生物必需微量元素之一，參與魚類體內多種物質代謝，對造血、生長、繁殖等具有重要作用，適量的銅離子有利于水產動物內環境穩定[1]。過量銅離子會導致水產動物機體結構和生理功能異常，發生各種病變和疾病；魚類的抗氧化系統也會受到傷害，并具有一定的遺傳毒性[2,3]。

銅離子是河流中常見的重金屬之一，魚類通過呼吸和取食等活動攝入體內。銅離子對魚類的急性毒性研究很多，而冷水條件下，銅離子對花鰍的急性毒性卻尚未見報道。本研究采用靜水生物測試法研究了銅離子對花鰍的急性毒性，評價了銅離子對花鰍的安全性，可為花鰍生態毒理學指標提供基礎數據，有利于花鰍養殖業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用水為全自動逆滲透純水機處理的純凈水，pH6.8～7.2，水溫（15±1）℃。實驗用魚為野生花鰍，2018 年5 月中旬采自通化市向陽村（E 126.033449°，N 41.691667°）河流中，使用0.1%高錳酸鉀溶液消毒后，于通化師范學院冷水魚養殖實驗室暫養池中暫養7 d。隨機選取540 尾健康、無傷病，體長（90±20）mm，體質量（4.1±0.6）g 個體，隨機分為6 組，每組3 個重復，每個重復30 尾。實驗容器為75 cm×60 cm×50 cm 的聚乙烯塑料水族箱，每箱盛放藥液容量180 L。

1.2 方法

中毒癥狀觀察及LC50測定：采用靜水法生物測試[4,5]，根據預實驗結果運用等對數間距法設置5 個濃度組：0.10 mg/L、0.17 mg/L、0.30 mg/L、0.51 mg/L和0.90 mg/L，對照組0 mg/L，重復3 次，實驗所用硫酸銅（CuSO4·5H2O）為分析純（天津市致遠化學試劑有限公司）。實驗期間不投喂，不充氣。實驗中每8 h 觀察觀察花鰍的行為、中毒癥狀、死亡等情況，記錄24 h、48 h、72 h 和96 h 的存活情況，采用線性回歸法求出LC50，安全濃度=96hLC50×0.1。

銅離子含量測定：實驗24 h 時，分別從各組中隨機取3 尾花鰍，經MS-222 麻醉后，用超純水將體表沖洗干凈，解剖取其鰓和肝臟，用超純水清洗，再用濾紙吸干，樣品在105℃烘箱中干燥24 h 至恒重待用[6]。銅離子含量參照《食品中銅的測定》方法[7]，使用石墨爐原子光譜吸收儀（4510F，上海儀電）檢測。

酶活性測定：實驗24 h 時，各濃度組和對照組分別隨機取3 尾花鰍，快速解剖取出腦、肝臟，稱取適量的樣品，按質量∶體積=1∶10 加入4℃預冷的生理鹽水，在冰浴下，用JY92-Ⅱ超聲波細胞破碎儀進行勻漿。勻漿液在4℃下4 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清液備用。采用考馬斯亮藍G-250 法測定蛋白質含量，POD（過氧化物酶，U/mgprot）、GDH（谷氨酸脫氫酶，U/mgprot） 活性和Glu （谷氨酸，μmol/gprot）濃度測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，按說明書測定。

1.3 數據處理

數據以（平均值±標準誤）表示，用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 花鰍在銅離子下的癥狀變化及LC50 測定

花鰍在不同濃度銅離子溶液中反應不同：低濃度出現中毒的癥狀比高濃度晚。剛投入含銅離子的水中，低濃度組的花鰍與對照組無明顯差別；3 h時，高濃度組（0.51 mg/L、0.90 mg/L）的花鰍局促不安、急劇游動，有時在水中側翻、打轉；9 h 時，高濃度組（0.51 mg/L、0.90 mg/L）的花鰍游動速度減慢，反應遲緩，逐漸失去運動能力，躺臥在水族箱底部，出現死亡。中毒初期，花鰍體色稍變淺，體表黏液較少，隨著中毒時間延長，體表分泌黏液逐漸增多。72 h 時，最高濃度組（0.90 mg/L）花鰍全部中毒死亡，胸鰭充血，口張開，身體側翻，鰭條均下垂。低濃度組（0.17 mg/L、0.30 mg/L）花鰍在脅迫24 h 時出現中毒癥狀，一旦中毒，癥狀基本相同。最高濃度組（0.90 mg/L）脅迫3 h 后，出現輕微的中毒癥狀，9 h 出現死亡，24 h 死亡率達（81.67±2.05）%（表1）。24 h 內0.51 mg/L 組接近半數死亡，其他低濃度組（0.10 mg/L、0.17 mg/L、0.30 mg/L）未出現死亡。隨著銅離子濃度的遞增，其毒性逐漸加大，花鰍死亡率上升；銅離子對花鰍的24 h、48 h、72 h 和96 h LC50分別為0.6040 mg/L、0.5148 mg/L、0.3812 mg/L 和0.298 mg/L，安全質量濃度為0.02398 mg/L（表2）。

表1 花鰍在不同銅離子濃度的死亡率Tab.1 Mortality of spined loach C.taenia exposed to different Cu2+concentrations

表2 銅離子對花鰍的急性毒性的線性回歸方程、LC50 及安全濃度Tab.2 The linear regression equation,LC50 and safe concentration of Cu2+to pined loach

2.2 花鰍肝臟及鰓中銅離子含量變化

隨著水中銅離子濃度的增加，肝臟和鰓中銅離子的濃度也增加，且肝臟中的銅離子濃度小于鰓中的銅離子濃度（圖1）；24 h 時肝臟中高濃度組（0.17 mg/L、0.30 mg/L、0.51 mg/L 和0.90 mg/L）與對照組差異顯著（P＜0.05），而鰓中0.30 mg/L、0.51 mg/L 和0.90 mg/L 組與對照組差異顯著（P＜0.05）。

2.3 花鰍在不同濃度的銅離子溶液中24h 時POD、GDH 活性和Glu 濃度變化

由圖2 可知：銅離子脅迫24 h 時，花鰍肝臟中POD 和GDH 活性隨銅離子濃度的增大而上升，不同濃度組間存在顯著差異，且最高濃度組（0.9 mg/L）的活性最大。花鰍腦中Glu 濃度隨水體中銅離子濃度增加呈相同趨勢（圖3），不同濃度組間亦存在顯著差異，最高濃度組（0.9 mg/L）的濃度最大。

3 討論

3.1 銅離子對花鰍毒性

花鰍Cu2+中毒癥狀為局促不安、急劇游動，水中側翻、打轉，游動速度減慢，反應遲緩，失去運動能力，躺臥在水族箱底部；花鰍中毒初期，肉眼可見體色稍變淺，體表黏液較少，但隨著中毒時間延長，分泌黏液逐漸增多，與中華鱘Acipenser sinensis 幼魚[8]、中國花鱸Lateolabrax maculatus 幼魚[9]、中華倒刺鲃Spinibarbus sinensis 幼魚[10]、細鱗鮭Brachymystax lenok 幼魚[11]、泥鰍Misgurnus anguillicaudatus[12]、金 魚Carassius auratus[13]、黃河鯉Cyprinus carpio[14]和錦鯉Cyprinus carpio[15]的急性毒性實驗的表現癥狀基本一致。銅離子濃度影響了花鰍體表黏液蛋白組分及含量，而黏液細胞在一定限度內對外界的銅離子脅迫具有保護性反應作用，但當超過其最大限度時，黏液細胞將遭到破壞，失去其生物活性功能。

3.2 銅離子對花鰍的致死效應及安全濃度評價

根據危險化學品魚類急性毒性分級實驗方法（GBT 21281-2007）[16]，銅脅迫96 h，花鰍的安全濃度為0.02398 mg/L，毒性分級為急性Ⅰ，銅對花鰍是劇毒物質，花鰍對水體銅污染敏感。已有研究表明：銅離子毒性受到水環境的理化因素、被檢測水生生物的種類、規格、生長等多種因素影響，如天然水體中有機質、懸浮物、鈣離子和鎂離子等多種物質都能降低硫酸銅的毒性，提高銅離子的安全濃度。本實驗中，銅離子對花鰍的半致死濃度和安全濃度是在銅離子單獨作用下的結果，對養殖具有一定參考價值，但在養殖生產過程中仍需根據實際情況進行具體分析和處理。

3.3 銅離子對花鰍鰓、肝臟、POD、GDH 和Glu 的影響

鰓是花鰍氣體交換的主要場所，由磷脂組成的鰓膜能直接吸附游離銅離子[17]。肝是魚類是富集和解毒重金屬的主要場所[18]，故本實驗選取鰓和肝臟檢測銅離子含量，發現花鰍鰓和肝臟銅離子濃度與水中銅離子濃度直接相關。銅離子脅迫會降低肝臟中酶的活性、增加脂質過氧化作用，引起脂肪肝[19]；損傷神經系統，造成腦機能障礙，尤其是小腦機能的障礙，使中毒魚失去平衡[20]，故本實驗選取肝臟中POD、GDH 活性和腦中Glu 濃度進行研究。

POD 是一種氧化還原酶，具有使毒性物質失活、調節氧濃度的作用，可分解細胞內的脂質過氧化物，減少細胞內過氧化物的積累，有助于緩解重金屬離子脅迫的傷害[13,21]。當花鰍受銅離子脅迫時，產生大量的自由基，攻擊細胞膜，使細胞膜發生脂質過氧化，導致細胞損傷，肝臟中的POD 活性上升，以期修復銅離子對花鰍肝臟組織的損傷。

谷氨酸脫氫酶（GDH）在肝細胞中含量最為豐富，是肝線粒體特異性酶，還與轉氨酶聯合參與完成肝臟氨基酸分解代謝，可作為肝臟損傷程度及急性肝壞死的判斷指標[22]，即肝臟重度損傷時肝細胞中的線粒體酶，如GDH 會被釋放出來。肝臟中的GDH 活性呈上升趨勢，表明銅離子對花鰍肝臟組織的損傷越來越嚴重。

Glu 作為興奮性神經遞質，分泌過多會導致神經元損傷。花鰍腦中的Glu 濃度上升，Glu 的攝取及轉運會發生障礙，引起Glu 堆積，而突觸間隙中的Glu 的大量堆積會導致神經元的毒性作用，最終導致中樞神經系統神經元的凋亡或壞死，造成腦損傷。