云南分心木總黃酮提取及抗氧化和對脂肪變性L02肝細胞的作用

張 鳳 馬雅鴿 張 希 楊婧娟 趙聲蘭

(云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500)

分心木又稱核桃隔膜，為胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)的木質隔膜，富含黃酮類化合物，有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降低血糖及抗心腦血管疾病等作用[1-3]。目前已有針對河北、新疆和甘肅等地的分心木黃酮提取及抗氧化活性的報道[4-6]，但未見有關分心木黃酮提取物體外降脂功效的研究報道。

中國核桃種植面積和產量世界第一，云南省又居全國之首，其種植面積2.87×106hm2，年產量超過8.50×105t，分心木占整個核桃的4%～5%，云南每年產生3.40×103～4.25×103t分心木[7-8]，目前大多分心木被丟棄或焚燒，僅有少量被開發為袋泡茶、速溶茶和保健功能酒[9-10]。試驗擬采用生產成本低且適用于大批量工業生產的乙醇回流提取法提取分心木總黃酮，采用單因素結合響應面試驗優化提取工藝，并研究分心木總黃酮的體外抗氧化活性及降低脂肪變性L02肝細胞TC和TG的活性，以期為分心木功能產品的開發提供理論依據，為延長核桃產業鏈提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

分心木：南澗縣紅云核桃加工銷售有限責任公司；

蘆丁：對照品，上海伊卡生物技術有限公司；

福林酚試劑、抗壞血酸(VC)：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

DPPH：美國Sigma公司；

人正常L-02肝細胞株：中國科學院昆明動物研究所；

胎牛血清：浙江天航生物科技有限公司；

非諾貝特：法國利博福尼制藥公司；

RPMI 1640培養液、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)測定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司;

20%醫用脂肪乳：四川科倫藥業股份有限公司；

醫用脂肪乳誘導液：20%醫用脂肪乳5 mL，用10%胎牛血清稀釋至50 mL。

1.1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計：UV-180型，上海精密科學儀器有限公司；

離心機：TD5A-WS型，湖南湘儀實驗室儀器有限公司；

酶標儀：INFINITE M200 PRO型，瑞士TECAN公司；

CO2培養箱：MCO-20AIC型，日本三洋有限公司；

倒置顯微鏡：Nikoneclipse TS 100型，尼康儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分心木總黃酮提取工藝流程

分心木→粉碎→過篩(60目)→乙醇回流提取→過濾→離心(2 900 r/min，6 min)→分心木總黃酮提取液

1.2.2 總黃酮提取得率測定 根據梁杏等[11]的方法，以蘆丁溶液質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線為：y=0.010 3x+0.013 6，相關系數R2=0.997 6，表明蘆丁溶液質量濃度與吸光度呈現良好的線性關系。按式(1)計算分心木總黃酮提取得率。

(1)

式中：

E——分心木總黃酮提取得率，%；

C——提取液黃酮的質量濃度，μg/mL；

V——提取液體積，mL；

N——稀釋倍數；

M——分心木質量，g。

1.2.3 單因素試驗 預試驗表明提取次數為2次的分心木總黃酮提取得率較提取1次和3次的高，故試驗將提取次數固定為2次。

(1) 提取時間對分心木總黃酮提取得率的影響：分別稱取2.000 0 g分心木5份，于液固比(V乙醇∶m分心木)為40∶1 (mL/g)、乙醇濃度60%和60 ℃條件下，分別回流提取20，40，60，80，100 min，回流提取2次，計算總黃酮提取得率。

(2) 乙醇濃度對分心木總黃酮提取得率的影響：分別稱取2.000 0 g分心木8份，按液固比(V乙醇∶m分心木)為40∶1 (mL/g)，分別加入濃度為15%，25%，35%，45%，55%，65%，75%，85%乙醇，于60 ℃及上述確定的提取時間，回流提取2次，計算總黃酮提取得率。

(3) 液固比對分心木總黃酮提取得率的影響：分別稱取2.000 0 g分心木6份，于60 ℃及上述確定的提取時間和乙醇濃度，液固比(V乙醇∶m分心木)分別為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 (mL/g)，回流提取2次，計算總黃酮提取得率。

(4) 提取溫度對分心木總黃酮提取得率的影響：分別稱取2.000 0 g分心木6份，按上述確定的提取時間、乙醇濃度和液固比，分別于40，50，60，70，80，90 ℃回流提取2次，計算總黃酮提取得率。

1.2.4 響應面試驗 在單因素試驗基礎上，運用Design Expert 8.0.6設計響應面試驗，以提取時間、乙醇濃度和提取溫度為因素，總黃酮提取得率為響應值優化提取條件。

(2)

式中：

K1——H2O2清除率，%；

A0——不加樣品的H2O2溶液吸光度值；

A1——加樣品的H2O2溶液吸光度值；

A2——不加H2O2溶液的樣品組吸光度值。

(3)

式中：

ΔA對照——1 min內對照管吸光度的變化值；

ΔA樣品——1 min內對照管吸光度的變化值。

(4)

式中：

K3——·OH清除率，%；

A0——試劑未損傷管吸光度值；

A1——試劑損傷管吸光度值；

A2——樣品未損傷管吸光度值；

A3——樣品損傷管吸光度值。

(5)

式中：

K4——DPPH清除率，%；

A1——4 mL DPPH溶液+4 mL樣品溶液的吸光度值；

A2——4 mL樣品提取液+4 mL乙醇的吸光度值；

A3——4 mL DPPH溶液+ 4 mL乙醇的吸光度值。

1.2.6 對脂變L02肝細胞總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的影響 采用醫用脂肪乳誘導正常L-02肝細胞構建脂肪變性L-02肝細胞模型。按曹麗娟等[13]的方法，取對數生長期L-02肝細胞，用G0液進行饑餓處理24 h，造模組給予醫用脂肪乳誘導液培養48 h，對照組給予正常培養液培養48 h，得脂肪變性L-02肝細胞。將脂肪變性L-02肝細胞分為模型組、陽性藥組和給藥組，對照組和模型組給予G0液2 mL，陽性藥組給予非諾貝特2 mL，給藥組則分別給予2 mL 300 μg/mL和400 μg/mL分心木總黃酮。每個濃度設3個復孔，給藥后繼續培養24 h，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2～3次，1.5 mL離心管收集刮取的細胞，按照試劑盒的說明書測定TC和TG含量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 分心木總黃酮提取工藝優化

2.1.1 單因素試驗 圖1(a)顯示，隨著提取時間的延長，總黃酮提取得率先升高后降低，80 min時總黃酮提取得率最高9.01%，在20～80 min時，分心木細胞壁逐漸被破壞，總黃酮物質溶出逐漸增加，提取得率逐漸提高，之后再繼續延長提取時間，其他非黃酮類物質溶出，同時長時間加熱破壞了溶出的黃酮，導致總黃酮提取得率下降[14]，故提取時間初步選擇80 min。圖1(b)顯示，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮提取得率呈先升高后下降趨勢。適當提高乙醇濃度，溶劑與總黃酮的極性靠近，總黃酮容易被提取出來，提取得率升高[15]，55%乙醇總黃酮提取得率最高7.093%，但乙醇濃度超過55%后，乙醇濃度增加，溶液沸點降低且高濃度乙醇和總黃酮的極性相差較大，不利于黃酮的提取，同時醇溶性雜質溶出增加，導致總黃酮提取得率下降[16]，故乙醇濃度初定為55%。圖1(c)顯示，40～80 ℃，溫度升高總黃酮提取得率增加，80 ℃總黃酮提取得率達到最高值10.34%。溫度高于80 ℃后，總黃酮提取得率隨溫度的升高反而下降，溫度過高，乙醇揮發增加，使乙醇濃度降低及溫度過高雜質溶出增加，導致總黃酮提取得率下降[17]，故初步確定提取溫度80 ℃。圖1(d) 顯示，隨液固比增加，總黃酮提取得率先升高后下降，在液固比(V乙醇∶m分心木)20∶1～40∶1 (mL/g)范圍，增加溶劑用量到液固比(V乙醇∶m分心木)40∶1 (mL/g)時，總黃酮提取得率最高9.92%，之后繼續增加溶劑反而會使其他醇溶性雜質容易溶解，使總黃酮提取得率下降，且溶劑過多增加回收成本，故液固比(V乙醇∶m分心木)取40∶1 (mL/g)。

圖1 乙醇濃度、提取時間、溫度和液固比對分心木總黃酮提取得率的影響Figure 1 Effects of ethanol concentration,extraction time, temperature and liquid-solid ratio on the yield of flavone extraction

2.1.2 響應面試驗優化提取工藝 實際生產中液固比過高會消耗大量溶劑，增大后續濃縮及回收溶劑的操作難度，增加能耗及生產成本，故將液固比(V乙醇∶m分心木)固定為40∶1 (mL/g)。以提取時間、乙醇濃度和提取溫度為考察因素，總黃酮提取得率為響應值設計響應面試驗，試驗因素與水平見表1，結果見表2。

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in the experiment

用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行多元回歸擬合和方差分析，得總黃酮提取得率回歸模型：

表2 響應面試驗及結果Table 2 Response surface test and results

Q=9.76+0.041A+0.079B-0.22AB-0.14AC+0.10BC-0.70A2-0.75B2-1.34C。

(6)

表3 總黃酮提取得率的回歸方程方差分析表?Table 3 Analysis of variance for regression equation of flavonoid extraction yield

AB、AC和BC交互作用對分心木總黃酮提取得率影響的響應面和等高線見圖2～4。圖2顯示，提取時間不變時，總黃酮提取得率隨乙醇濃度增加而增加，55%時出現極值后降低；乙醇濃度不變時，總黃酮提取得率隨提取時間增加先升高后降低。從圖2(b)可看出，等高線呈橢圓形，說明AB交互作用對分心木黃酮提取量的影響較大。圖3顯示，提取溫度比提取時間對分心木總黃酮提取得率的影響大，總黃酮提取得率隨溫度增加而增加，在80 ℃時出現極值后降低，等高線呈橢圓形，說明AC交互作用對黃酮提取量的影響較大，且圖3(b)的等高線沒有圖2(b)扁平，說明AB交互作用對黃酮提取量的影響大于AC。圖4顯示，分心木總黃酮提取得率隨乙醇濃度的增加先升高后降低，隨提取溫度的增加而升高。圖4(b)的等高線沒有圖3(b)扁平，說明BC的交互作用沒有AB、AC對試驗結果影響大。

圖2 提取時間和乙醇濃度對總黃酮提取得率的交互影響Figure 2 Interactive effects of extraction time and ethanol concentration on flavone extraction yield

圖3 提取時間和提取溫度對總黃酮提取得率的交互影響Figure 3 Interactive effects of extraction time and temperature on flavonoid extraction yield

圖4 提取溫度和乙醇濃度對總黃酮提取得率的交互影響Figure 4 Interactive effects of extraction temperature and ethanol concentration on flavone extraction yield

用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的試驗結果進行優化分析，得分心木總黃酮最優提取條件為乙醇濃度55.25%，提取溫度80.70 ℃，回流提取時間80.46 min，總黃酮提取得率9.84%。結合實際，將最優提取條件調整為乙醇濃度55%，提取溫度80 ℃，回流提取時間80 min。在此條件下，進行3次平行驗證實驗，總黃酮提取得率9.88%，與預測值較吻合，證明該響應面優化試驗結果可靠。有文獻[4-5]報道分心木中黃酮提取得率為5.17%～6.70%，低于試驗分心木黃酮提取得率，可能是因為不同地區分心木黃酮含量有所差別，或是因為不同提取條件對提取得率有影響。

2.2 分心木總黃酮體外抗氧化活性

圖5 分心木總黃酮對自由基的清除作用Figure 5 Free radical scavenging effect of distractive wood flavonoids

2.3 分心木總黃酮對脂變L02肝細胞TC和TG的影響

由表4可知，與正常組相比，模型組TC和TG含量顯著升高(P<0.001)，說明脂變L02肝細胞模型建立成功；與模型組相比，陽性藥非諾貝特組和分心木總黃酮300，400 μg/mL劑量組的TC和TG含量均顯著降低，且分心木總黃酮降低脂變L02肝細胞TC和TG呈劑量效應。試驗結果表明，分心木總黃酮降低脂肪變性L02肝細胞TC和TG的活性高。

表4 分心木總黃酮對脂變L02肝細胞TC和TG的影響?Table 4 Effects of distracting flavonoids on TC and TG in Steatosis L02 liver cells

3 結論

試驗采用響應面設計法優化云南核桃分心木總黃酮提取最優條件：乙醇濃度55%、提取溫度80 ℃、提取時間80 min、液固比(V乙醇∶m分心木)40∶1 (mL/g)，此條件下分心木總黃酮提取得率為9.88%，高于文獻[4-5]報道的(5.17%～6.70%)。抗氧化及降低TG、TC的研究發現，云南分心木總黃酮具有較高的抗氧化活性和降低脂肪變性L02肝細胞TC及TG的活性，說明分心木黃酮可開發作為食品、藥品、化妝品等行業的天然抗氧化劑，可開發為降脂藥物。試驗未對分心木總黃酮物質進行純化分離，未進行分心木總黃酮體內降脂作用研究，后續可采用大孔吸附樹脂、硅膠及凝膠進行分離純化，采用高脂模型大鼠或小鼠進行分心木總黃酮的降脂作用研究，探究分心木黃酮抗氧化及降脂的量效關系、物質基礎及作用機制。