響應(yīng)面—滿意度函數(shù)優(yōu)化姜黃郁金多糖和黃酮共提工藝條件及其抗氧化性研究

侯敏娜 侯少平 吳滿芳 王 珊 彭修娟 劉 峰 閆歡歡

(1. 陜西國際商貿(mào)學(xué)院,陜西 咸陽 712046；2. 都昌縣第二人民醫(yī)院，江西 九江 332600；3. 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

姜黃郁金又稱黃絲郁金，為姜黃屬植物姜黃(CurcumaLonga)的干燥塊根[1]，為常用中藥材,具有保肝利膽、降血脂、免疫抑制、抗癌、抗炎、抗氧化、中樞抑制等[2-3]藥理作用。郁金不僅可作為行氣舒肝解郁、降血脂等的藥膳品(如郁金茶、郁金木香茶、郁金清肝茶、荷葉郁金粥等)；還可以用于抗皺、美膚的化妝品領(lǐng)域；其色素已被廣泛用作食品和染料的添加劑[4]。郁金含有揮發(fā)油、多糖、黃酮、微量元素等[2,5]多種化學(xué)成分。目前，有關(guān)郁金的研究主要集中于治療肝病、抑郁癥、癲癇、哮喘等作用機(jī)制推測(cè)[6-10]，揮發(fā)油成分分析和含量測(cè)定方法[11-12]，以及不同品種郁金化學(xué)成分、藥理作用分析等[2]方面。而有關(guān)郁金多糖、黃酮共提工藝及其藥理活性的分析比較研究尚未見報(bào)道。

多糖和黃酮類成分在植物中普遍存在，具有抗氧化、防衰老、抗腫瘤等共性特點(diǎn)。其常用提取方法有溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法等[13]。與其他方法相比，超聲提取法具有省時(shí)、省溶劑、易操作、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)[14]；響應(yīng)面試驗(yàn)以較少的試驗(yàn)次數(shù)、較短的提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，已被廣泛應(yīng)用于生物、化工及食品加工技術(shù)的模型建立及條件優(yōu)化[15]；滿意度函數(shù)是一種適合于多目標(biāo)優(yōu)化的方法，將不同響應(yīng)值轉(zhuǎn)化為0～1的無量綱數(shù)值，實(shí)現(xiàn)了多響應(yīng)值優(yōu)化轉(zhuǎn)變?yōu)閱雾憫?yīng)值優(yōu)化，易于尋求整體最優(yōu)[16]。

試驗(yàn)擬采用超聲提取法，利用響應(yīng)面—滿意度函數(shù)法對(duì)姜黃郁金多糖和黃酮類成分共提條件進(jìn)行優(yōu)化；并以DPPH自由基、ABTS自由基清除率為指標(biāo)，分析姜黃郁金多糖和黃酮的抗氧化活性，旨在為姜黃郁金多糖和黃酮的深加工及藥材資源的廣泛、有效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃郁金：經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室楊新杰教授鑒定為CurcumaLonga的根莖，陜西康宇制藥有限公司；

蘆丁對(duì)照品(批號(hào)為100080-201811)、葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)為100082-201803)：中國藥品生物制品鑒定所；

DPPH、ABTS：上海源葉生物科技有限公司；

無水乙醇、硫酸、亞硝酸鈉、苯酚、硝酸鋁、過硫酸鉀、維生素C：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)：FW-100型，北京科偉永興儀器有限公司；

電子分析天平：YP2102型，北京賽多利斯儀器有限公司；

數(shù)控超聲波提取器：KQ5200型，昆山市超聲儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-111型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理 將姜黃郁金于50 ℃干燥，粉碎，過5號(hào)篩，封存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

(1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取于105 ℃干燥后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5.032 mg，用純化水定容至50 mL，搖勻，得濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照硫酸—苯酚法[16-18]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=6.262 5x-0.012 8，R2=0.994 8。

(2) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取于105 ℃干燥后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.069 mg，用50%乙醇定容至25 mL，搖勻，得濃度為0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照文獻(xiàn)[19]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=1.891 0x+0.003 5，R2=0.997 4。

1.3.3 多糖和黃酮提取率測(cè)定 根據(jù)1.3.2方法進(jìn)行測(cè)定，按式(1)計(jì)算姜黃郁金多糖和黃酮提取率。

Y=[(C×V×N)/M]×100%，

(1)

式中：

Y——姜黃郁金多糖或黃酮提取率，%；

C——姜黃郁金多糖或黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——姜黃郁金多糖或黃酮體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——藥材質(zhì)量，mg。

1.3.4 滿意度函數(shù) 以姜黃郁金多糖和黃酮提取率為響應(yīng)值，按式(2)轉(zhuǎn)化為無量綱的期望值di(0≤di≤1)，d越接近1，效果越好。將多個(gè)響應(yīng)值的wn次方根的積作為滿意度值D[16,19]，并按式(3)進(jìn)行計(jì)算。

(2)

(3)

式中：

Yi(x)——第i個(gè)指標(biāo)的響應(yīng)值；

Ymax,i、Ymin,i——最高、最低響應(yīng)值；

將姜黃郁金多糖提取率設(shè)為Y1，黃酮提取率設(shè)為Y2，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[16,20]得知姜黃郁金多糖的最高提取率為1.151%，最小為0.000%；黃酮的最高提取率為0.314%，最小為0.000%。w1設(shè)為0.6，w2設(shè)為0.4，得滿意度D。利用響應(yīng)面軟件對(duì)滿意度進(jìn)行分析，滿意度對(duì)應(yīng)最大值的提取工藝即為最優(yōu)提取條件。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

(1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：在料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超聲時(shí)間20 min，超聲溫度50 ℃下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(0%，20%，40%，60%)對(duì)姜黃郁金黃酮和多糖提取率的影響。

(2) 料液比：在提取溶劑為水，超聲時(shí)間20 min，超聲溫度50 ℃下，考察料液比[m姜黃郁金∶V水分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL)]對(duì)姜黃郁金黃酮和多糖提取率的影響。

(3) 超聲時(shí)間：在提取溶劑為水，料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超聲溫度50 ℃下，考察超聲時(shí)間(15，20，25，30 min)對(duì)姜黃郁金黃酮和多糖提取率的影響。

(4) 超聲溫度：在提取溶劑為水，料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超聲時(shí)間20 min下，考察超聲溫度(30，40，50，60 ℃)對(duì)姜黃郁金黃酮和多糖提取率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以姜黃郁金黃酮和多糖提取率的滿意度為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選最佳提取工藝條件。

1.3.7 姜黃郁金多糖和黃酮抗氧化能力測(cè)定

(1) 對(duì)DPPH自由基的清除能力：參照文獻(xiàn)[21-23]并修改，分別配置濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的姜黃郁金多糖和黃酮樣品溶液。移取2 mL不同濃度的兩種樣品溶液，各加入2 mL DPPH溶液，搖勻，暗處反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處吸光度。以無水乙醇為空白對(duì)照，按式(4)計(jì)算自由基清除率。

(4)

式中：

K——自由基清除率，%；

Ai——樣品組吸光度；

Aj——樣品對(duì)照組吸光度；

A0——空白對(duì)照組吸光度。

(2) 對(duì)ABTS自由基的清除能力：參照文獻(xiàn)[23-24]并修改，測(cè)定734 nm處吸光度。以無水乙醇為空白對(duì)照，按式(4)計(jì)算自由基清除率。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007軟件制作圖表，用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1可知，當(dāng)提取溶劑為水時(shí)，姜黃郁金多糖和黃酮提取率均達(dá)最高，說明姜黃郁金多糖和黃酮極性偏大，在水中溶解度最好；當(dāng)料液比(m姜黃郁金∶V水)為1∶20 (g/mL)時(shí)，兩者提取率均達(dá)最高，隨著溶劑的增加，大部分水溶性雜質(zhì)浸出，阻止目標(biāo)成分溶出，提取率降低；當(dāng)超聲時(shí)間為20 min 時(shí)，姜黃郁金多糖提取率達(dá)最高，而黃酮提取率在15～20 min下降比較緩慢，超過20 min后下降較明顯，可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長，超聲波的振蕩作用破壞了姜黃郁金中小分子多糖和黃酮類成分，使提取率降低；當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，姜黃郁金多糖和黃酮提取率均達(dá)最大，隨著超聲溫度的升高，小分子姜黃郁金黃酮和多糖成分發(fā)生分解或改變，提取率降低。故姜黃郁金多糖和黃酮共提條件為：以水為提取溶劑、料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶20 (g/mL)、超聲時(shí)間20 min、超聲溫度50 ℃。

圖1 各因素對(duì)姜黃郁金多糖及黃酮共提得率的影響Figure 1 Effect of different factors on the co-extraction rate of polysaccharides and flavonoids from Curcuma Longa

2.2 姜黃郁金多糖和黃酮共提工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以姜黃郁金多糖和黃酮提取率的滿意度為響應(yīng)值，選取料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度為因素，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factor level table

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析 對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design of response surface experiment scheme

D=0.80+0.055A-0.066B+0.046C+9.675E-003AB-4.250E-003AC+0.048BC-0.28A2-0.089B2-0.11C2。

(5)

表3 方差分析?Table 3 Analysis of variance

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖2可知，姜黃郁金多糖和黃酮共提滿意度隨超聲時(shí)間和超聲溫度的延長呈先升高后下降趨勢(shì)，但變化緩慢，等高線圖略偏圓形，說明二者交互作用不顯著；料液比和超聲時(shí)間交互作用的曲面較陡，說明其對(duì)姜黃郁金多糖和黃酮共提滿意度影響較大，等高線圖近似橢圓形，說明兩因素與響應(yīng)值之間交互作用影響較大；料液比和超聲溫度交互作用的等高線圖呈橢圓形，說明二者與響應(yīng)值之間交互作用顯著。綜上，姜黃郁金多糖和黃酮共提條件范圍：超聲溫度45～55 ℃，料液比(m姜黃郁金∶V水) 1∶20～1∶25 (g/mL)，超聲時(shí)間15～25 min。

圖2 各因素交互作用對(duì)姜黃郁金多糖和黃酮共提滿意度的影響Figure 2 The satisfaction of Curcuma Longa polysaccharides and flavonoids co-extraction with different factors

2.3 工藝驗(yàn)證

經(jīng)求導(dǎo)可得，姜黃郁金多糖及黃酮共提取的最佳工藝條件為：超聲溫度50 ℃，料液比(m姜黃郁金∶V水)1.0∶22.3 (g/mL)，超聲時(shí)間20 min，此時(shí)的預(yù)測(cè)滿意度為0.826 3，姜黃郁金多糖提取率為1.04%，黃酮提取率為0.25%。考慮實(shí)際的可操作性，將姜黃郁金多糖及黃酮共提條件調(diào)整為：超聲溫度50 ℃，料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶22 (g/mL)，超聲時(shí)間20 min。通過3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最佳工藝條件下的滿意度為0.823 7，與預(yù)測(cè)值相差極小，說明運(yùn)用該試驗(yàn)分析方法得出的提取工藝可靠、可行，此時(shí)多糖提取率為1.01%，黃酮提取率為0.23%。

2.4 姜黃郁金多糖和黃酮的抗氧化性

由圖3可知，姜黃郁金多糖和黃酮對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基具有一定的清除能力，但兩者作用效果都明顯弱于維生素C，且黃酮對(duì)兩種自由基的清除能力強(qiáng)于多糖，這與黃酮類屬于多酚化合物，是天然抗氧劑有關(guān)。當(dāng)姜黃郁金粗多糖和黃酮質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除能力達(dá)最大，分別為(42.91±0.54)%，(65.46±0.38)%。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除能力達(dá)最大，為(33.28±0.69)%；當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除能力達(dá)最大，為(34.26±0.18)%。

圖3 姜黃郁金多糖、黃酮及維生素C對(duì)自由基的清除能力Figure 3 The scavenging ability of Curcuma Longa polysaccharides, flavonoids and VC to different free radicals

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，姜黃郁金多糖及黃酮共提條件為：以水為提取溶劑、超聲溫度50 ℃、料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶22 (g/mL)、超聲時(shí)間20 min，此時(shí)姜黃郁金多糖、黃酮提取率分別為1.01%，0.23%，滿意度為0.823 7。在抗氧化作用的濃度范圍內(nèi)，當(dāng)姜黃郁金多糖和黃酮質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除能力均達(dá)最大，分別為(42.91±0.54)%，(65.46±0.38)%；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除能力達(dá)最大，為(33.28±0.69)%；當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除能力達(dá)最大，為(34.26±0.18)%，說明姜黃郁金多糖和黃酮具有較好的清除自由基能力，且黃酮的清除能力強(qiáng)于多糖。姜黃郁金多糖和黃酮成分組成較多且復(fù)雜，而抗氧化活性可能是其中一種或幾種成分發(fā)揮作用，其具體功能成分物質(zhì)有待于后續(xù)研究。