雨生紅球藻天然蝦青素提取研究進展

李 艷 高 靜

(1. 廣東藥科大學食品科學學院，廣東 中山 528458；2. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088)

蝦青素又名蝦紅素、蝦黃質，屬于類胡蘿卜素衍生物，其分子結構中含有11個共軛雙鍵、2個β-紫羅蘭酮環以及羥基[1-2]。蝦青素具有很強的抗氧化活性，比β-胡蘿卜素、玉米黃質和葉黃素的抗氧化效力高10倍，比維生素E的高100倍[3]。此外，蝦青素具有抗衰老、抗炎、抗癌、增強免疫力等功能[4-5]，還可保護中樞神經系統、用于預防和治療心血管疾病和動脈粥樣硬化等[6]。蝦青素突出的生物活性使其被廣泛應用于食品、化妝品、水產養殖和醫藥等領域[7-8]。

化學合成和天然提取是獲取蝦青素的兩種主要途徑，但二者獲取的蝦青素在結構、功能、應用及安全等方面存在較大差異，目前商業中95%以上為化學合成蝦青素[9]。合成蝦青素中3S—3'S結構不超過25%，而天然蝦青素中90%以上為3S—3'S結構，因此天然蝦青素具有更強的生物活性和更高的生物利用度[10-11]。據報道[12-13]，天然蝦青素的抗氧化活性是合成蝦青素的90倍，且能與蛋白質或脂質結合，具有更好的穩定性。

雨生紅球藻中蝦青素的積累量最高可達5%，是天然蝦青素的最佳生物來源[10]。孟春曉等[14]綜述了雨生紅球藻中蝦青素提取方法的研究進展，介紹了幾種常見蝦青素提取方法的效果及優缺點，并指出脅迫環境下提高雨生紅球藻中蝦青素含量的重要性。趙曉燕等[15]針對雨生紅球藻中蝦青素的功能、破壁及提取方法的研究進展進行了綜述。近年來，隨著離子液體(ILs)、低共熔溶劑(DES)等新型溶劑的出現，為蝦青素的提取提供了新的技術思路。文章擬介紹天然蝦青素的生物來源、功能及應用研究的新進展，對比分析雨生紅球藻的不同破壁方法和蝦青素的提取方法，重點介紹近期國內外對雨生紅球藻蝦青素(HP-AX)高效分離提取的新方法，旨在為推動天然蝦青素的規?；a提供依據。

1 天然蝦青素的生物來源、功能及應用

與法夫酵母(0.4%)、太平洋磷蝦(0.012%)、北極蝦(0.12%)等天然來源相比，雨生紅球藻中蝦青素含量為1%～5%[16]。蝦青素在雨生紅球藻中的積累量受光照、溫度、激素、營養物質和鹽影響[17-18]。蝦青素的共軛雙鍵、酮基和羥基使其具有多種生理功能[2, 11]。在食品和醫藥領域利用蝦青素抗氧化、抗炎等功效制備功能食品與藥物[19-20]，而蝦青素的抗氧化、抗衰老和防止皮膚損傷的功能可以達到美容養顏和保水保濕的效果[21-22]。此外，蝦青素與肌紅蛋白結合，賦予水產動物誘人的紅色及色素沉著能力，在水產養殖和飼料業中被廣泛應用[23]。HP-AX突出的生物功能可能與以下3個特性有關[24]：① 95.7%以酯化形式存在；② 3S-3'S是主要的立體異構體；③ 存在少量葉黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃質等輔助類胡蘿卜素。

Davinelli等[25]對蝦青素的安全性及生物利用度進行了論述，并指出HP-AX作為一種安全的添加劑被允許添加至動物飼料中的劑量逐漸增大，且在多種動物及人體中均具有較好的生物吸收利用率。Brendler等[26]綜述了蝦青素的安全性，介紹了向FDA遞交申請作為新食品成分的蝦青素均來源于雨生紅球藻。上述研究表明，HP-AX作為一種安全的蝦青素來源，其需求量不斷增長且應用范圍不斷增大，從雨生紅球藻中高效提取蝦青素具有重要意義。

2 雨生紅球藻的破壁方法

雨生紅球藻壁厚1.8～2.3 μm，其成熟紅細胞壁是由海藻素、甘露聚糖和纖維素及異質多糖組成的三層結構[11,27]。這種剛性細胞壁結構嚴重阻礙了提取溶劑向細胞內滲透，增加了蝦青素提取的難度。因此，破壁處理是提取蝦青素的必要手段。常用于雨生紅球藻壁破碎的方法有物理、化學和生物法。表1列舉并比較了在不同破壁、提取方法下獲得的HP-AX提取率。

表1 破壁、提取方法對HP-AX提取率的影響?Table 1 Effects of different cell-wall disruption and extraction methods on the extraction efficiency of HP-AX

2.1 物理破壁法

研磨法、凍融溫差法、超聲法、高壓勻漿法依靠作用過程中產生的機械力、超聲波效應、碰撞擠壓效應等破壞細胞壁，是雨生紅球藻破壁的常用方法[15,37]。趙曉燕等[15]列舉并比較了以上幾種常用物理破壁法對HP-AX提取率的影響，發現研磨和超聲處理效果較好，但蝦青素提取率不超過4%。孟昂等[38]用液氮研磨破壞雨生紅球藻壁，以200 W超聲輔助乙酸乙酯—乙醇(1∶2，體積比)在料液比9∶50 (mL/mg)和39 ℃條件下處理雨生紅球藻后，將其置于40 ℃水浴震蕩20 min，所得HP-AX提取率為85.1%。高壓脈沖電場是一種新型的破壁方法，利用高壓電流改變細胞的通透性，使胞內化合物選擇性釋放。Martinez等[27]以乙醇為提取溶劑，對雨生紅球藻施加1 kV/cm的電場預處理6 h比采用研磨和超聲預處理的提高了20%。該方法產生的能量適中，不會引起產品溫度升高而導致熱敏性活性物質變性，利于保持蝦青素的穩定性和生物活性，但耗時較長。

物理破壁法引起的原料成分損失較少，但單獨使用破壁效果不佳，為獲得較高的蝦青素提取率往往需與化學溶劑協同作用。此外，物理破壁協同溶劑一步提取是實現短時高效提取HP-AX需重點關注的問題。

2.2 化學破壁法

化學破壁法是利用溶劑與雨生紅球藻壁間的化學作用使細胞破損，無機酸、有機溶劑和ILs是常用的破壁試劑。任曉麗等[39]利用硫酸在60 ℃下破壞雨生紅球藻壁纖維素和蛋白質分子間的化學鍵，發現蝦青素提取量比對照組提高了近45倍。吳世林等[28]利用二甲基亞砜和乙醇有效結合研磨法使雨生紅球藻破壁率高達99%。化學破壁法與物理破壁法結合使用能有效破壞雨生紅球藻壁，且該方法簡單、易操作、對設備要求低。然而，無機酸和有機溶劑容易對蝦青素造成化學污染。

ILs是由陰、陽離子組成的一種低溫熔融鹽，不同陰、陽離子形成的ILs顯示出不同的極性，但極性大的ILs對纖維素等多糖物質具有較高溶解度，利于破壞和穿透雨生紅球藻壁。Desai等[40]研究發現，1-乙基-3甲基咪唑磷酸二丁基酯([Emim]DBP)的陰、陽離子通過與細胞壁甘露聚糖的氫鍵作用，使雨生紅球藻細胞周圍形成一層糖膜，因此滲透或削弱細胞壁，獲得了較高的蝦青素提取率(77%)。Choi等[31]發現1-乙基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽([Emim]HSO4)、1-乙基-3-甲基咪唑對甲苯磺酸鹽([Emim]CH3SO3)、1-乙基-3-甲基咪唑雙(三氟甲基磺?；?酰亞胺([Emim](CF3SO2)2N)等多種ILs可以有效撕裂、破壞雨生紅球藻壁，從而提高蝦青素提取率(86%～99%)，其破壁前后的細胞形貌如圖1所示。此外，Liu等[41]指出，由于咪唑類ILs有效破壞纖維素分子的氫鍵，其對雨生紅球藻壁的破壞程度高于含吡啶和銨基陽離子的離子液體。ILs破壁法具有溫和、有效的優點，但能高效破壞雨生紅球藻壁的ILs局限于咪唑類，其價格顯著高于銨基類ILs。

圖1 離子液體預處理雨生紅球藻破壁前后的細胞形貌[31]

2.3 生物酶法破壁

纖維素復合酶、果膠酶和蛋白酶等通過破壞雨生紅球藻壁的纖維素、多糖、蛋白質的氫鍵、糖苷鍵及肽鍵，從而導致細胞壁破裂和胞內物質流出。酶解法破壁率通常為70%左右[15]。余紹蕾等[42]用0.5%復合纖維素酶在45 ℃酶解雨生紅球藻5 h，隨后在40 MPa壓力下均質2次，將破壁率提高至95%以上，比單獨使用高壓均質的破壁率高18.07%。然而，酶法成本高、耗時長并存在的酶變性問題制約了其應用。

3 蝦青素的提取方法

雨生紅球藻經破壁后，HP-AX的提取方法主要包括油溶提取、化學試劑提取、超臨界提取、雙水相提取、酶解輔助提取等。

3.1 油溶法

常用于HP-AX提取的天然植物油有橄欖油、大豆油、玉米油和葡萄籽油。Kang等[33]證明，常溫下不同植物油對HP-AX提取率的順序為橄欖油(93.9%)> 大豆油(91.7%)> 玉米油(89.3%)> 葡萄籽油(87.5%)。江燕等[43]發現天然植物油中含有油酸、亞油酸、棕櫚酸等大量不飽和脂肪酸(PUFA)，且PUFA含量為葡萄籽油>橄欖油>大豆油>玉米油。據此推測，PUFA的不飽和鍵與末端羧基結構可能為雨生紅球藻壁多糖、蛋白質及蝦青素提供結合位點。因此，橄欖油對未破壁HP-AX提取率較高，但葡萄籽油的HP-AX提取率卻最低，其組分對蝦青素提取的抑制作用需進一步研究。油溶法具有安全無毒、簡便、有效的優點，但提取時間長且蝦青素與高沸點油的難分離性增加了分離成本。

3.2 化學試劑提取法

3.2.1 有機溶劑 蝦青素屬于脂溶性物質且帶有羥基、羰基等極性基團，因此溶劑的極性與蝦青素溶解能力密切相關，且極性大的有機溶劑更容易滲透雨生紅球藻壁。趙曉燕等[15]指出蝦青素在有機溶劑中的溶解度隨溶劑極性的增加而減小。王紅霞等[44]研究發現，20 ℃、2 h下不同溶劑對破壁HP-AX的提取能力依次為二氯甲烷>乙酸乙酯>丙酮>95%乙醇>異丙醇。徐煜等[45]比較了超聲輔助提取HP-AX的效果，蝦青素提取率大小為丙酮>二氯甲烷/甲醇(V二氧甲烷∶V甲醇=1∶3) >甲醇>氯仿。此外，研究[46]證明極性溶劑與非極性溶劑聯合使用時的提取效果更佳，如以正己烷與乙醇混合液為提取溶劑、料液比(m料∶V提取劑)1∶640 (g/mL)、51 ℃下提取42 min可以使HP-AX提取率達92.04%。有機溶劑法相對簡單、有效、后續分離技術成熟，但試劑用量大且丙酮等有毒試劑的使用仍存在極大隱患。

3.2.2 超分子溶劑 超分子溶劑(SUPRAS)是兩親化合物(如羧酸、烷醇、烷基酚等)通過分子間有序的自組裝過程形成的具有納米結構的膠束聚集體[47-48]。SUPRAS存在離子—離子、離子—偶極、偶極—偶極、氫鍵、π—π和陽離子—π等多種分子間作用力，可為蝦青素提供多種結合位點和萃取力[48-49]。因此，SUPRAS能有效透過細胞壁提取HP-AX， Salatti-Dorado等[34]用辛酸、鹽酸和100%乙醇制成的SUPRAS獲得了極高的蝦青素提取率(96%)。SUPRAS具有合成簡單、極性范圍寬、可設計的特性，在HP-AX提取方面具有巨大潛力，但關于兩性分子與蝦青素間的主要作用力及作用機制有待進一步研究。

3.2.3 離子液體 ILs具有低熔點、高熱穩定性、強溶解性和可設計性的特點，被廣泛應用于蝦殼甲殼素、黃連生物堿、牡丹黃酮等天然產物活性物質提取中[50-51]。ILs對HP-AX的提取效果不僅受陰、陽離子影響，還與其黏度、氫鍵接受能力(β值)及極性大小有關。Fan等[52]合成了一種成本比咪唑ILs低且生物相容性更好的質子ILs，即己酸乙醇銨(EAC)，在固液比1∶20 (g/g)、微波功率210 W下，其能有效溶解雨生紅球藻壁的甘露聚糖并在50 s內一步提取蝦青素，其提取效果比方婷等[53]用丙酮在50 ℃下水浴提取1 h的高約3.6倍。此外，與二乙醇己酸銨(DEAC)和三乙醇己酸銨(TEAC)相比，EAC因具有更高的氫鍵接受能力(β= 1.14)和更低的極性[ET(30) = 56.3]，對HP-AX的提取效果更為理想。離子液體的黏度大，常通過添加共溶劑來提高傳質速率。Liu等[41]向純ILs中添加水可以有效降低ILs黏度，提高HP-AX提取率。ILs既可以破壁又可以提取，還具有反應條件溫和、操作簡單、可循環的優點。但ILs具有低毒性且價格昂貴。

3.2.4 低共熔溶劑 低共熔溶劑(DES)是由氫鍵供體與氫鍵受體組成的一種ILs類似物，其出現解決了ILs成本高和具有毒性的問題[54]。除了具有與離子液體相似的物理性質外，DES還具有低成本和高生物降解的特點，近年來備受關注[55]。Lee等[56]對比了65 W超聲90 min條件下以丙酮為提取溶劑，DES(季鏻鹽和1,2-丁二醇組成)或1-乙基-3-甲基咪唑溴([Emim][Br])為添加劑提取梭子蟹蝦青素，發現以DES為添加劑的蝦青素提取率是[Emim][Br]的1.5倍左右。Rodrigues等[55]證明了DES在60 ℃、2 h下對HP-AX的提取效率約是丙酮的5倍。DES提取法具有高效、簡便、低毒或無毒、成本低的優點，在萃取領域已成為替代ILs的良好溶劑。但DES的黏度大，通過添加助劑降低黏度或者設計新的低黏度DES是推動DES廣泛應用的前提。

3.3 超臨界提取

超臨界萃取技術是利用溶劑在超臨界狀態下對目標產物具有高溶解力而達到萃取的目的[57]。超臨界萃取劑分為非極性溶劑(CO2、乙烯、乙烷等)和極性溶劑(甲醇、乙醇、丙酮等)[58]。其中，非極性CO2具有強溶解能力、化學惰性和低萃取溫度，可以保護產物的活性和防止其降解[7, 59]。為了提高選擇性和萃取效率，往往加入共溶劑提高CO2在超臨界條件下對目標產物的溶解能力，如超臨界CO2以極性乙醇為共溶劑，可以增強溶劑細胞滲透能力，未經破壁處理的HP-AX提取率也可達98%[60]。超臨界萃取技術是一種清潔、綠色的技術，在蝦青素的提取方面具有良好的應用前景。

3.4 雙水相提取

雙水相提取蝦青素主要利用蝦青素與互不相溶兩相間的相互作用力差異達到高效分離萃取的目的，具有環境友好、能耗低、穩定性好的優勢。Khoo等[61]用2-丙醇和硫酸銨構成雙水相體系(ABS)提取HP-AX，其提取率為95.08%。ILs構建的ABS具有較高的穩定性和生物相容性，其中三丁基膦溴化銨([P4448]Br)和磷酸鉀(K3PO4)ABS常溫下對蝦殼蝦青素提取率達93.08%[62]。張莉莉等[35]利用[P4448]Br和K2HPO4/KH2PO4組成的pH可調節ABS直接提取HP-AX，在超聲功率75 W、超聲時間60 min 的條件下HP-AX提取率為96.09%。ABS表面性質、電荷作用和其他作用力不僅能有效溶解雨生紅球藻壁的多糖，且[P4448]Br的氫原子與蝦青素的羥基之間能形成強氫鍵作用。雙水相體系從雨生紅球藻中提取蝦青素的優勢還體現在蝦青素溶解于IL富集相，其他親水性分子溶解于鹽富集相，利于蝦青素的分離純化。

3.5 酶解輔助提取

酶解法具有裝置簡單、適用范圍廣、重現性好的優點。張曄等[63]用纖維素酶和果膠酶組成的復合酶直接提取HP-AX，在pH 4.9、49 ℃下酶解6 h得到71.08%的HP-AX提取率，而Huang等[64]用堿性蛋白酶酶解1 h得到的HP-AX提取率為80%。Zhao等[32]用果膠酶輔助乙酸乙酯提取HP-AX獲得75.30%的提取率。酶輔助提取避免了化學方法對蝦青素活性的影響，但酶制劑比較昂貴，可以聯用其他方法以降低成本。

3.6 物理輔助提取

目前，常用的物理輔助提取方法有超聲輔助、高壓輔助和磁場輔助。超聲波產生的空化、乳化、擴散等效應能破壞雨生紅球藻壁，提高溶劑的滲透性和傳質能力，促進蝦青素與溶劑的混合。Khoo等[61]研究表明，添加超聲輔助雙水相提取HP-AX，其提取率提高了16.70%。高壓輔助利用壓力使雨生紅球藻細胞相互擠壓、變形甚至破碎，加快提取速度和提高提取效率，如使用加壓乙醇可在20 min內完成HP-AX的提取[29]。磁場輔助提取是一種通過在萃取液中添加磁性敏感添加劑以吸引目標生物分子的新分離技術[47]。這種磁性敏感劑可以通過改變材料的某些性質(擴散系數、滲透壓、黏度、表面張力和溶解度)，影響相平衡組成，強化分離過程[65]。因此，磁場可以改變雨生紅球藻壁溶解度、滲透壓等，使溶劑直接滲透細胞壁提取蝦青素，如與超聲輔助相比，磁場輔助萃取雨生紅球藻可獲得最高的蝦青素提取率(40.27%)[66]。

超聲、高壓等物理輔助可對雨生紅球藻壁造成破壞，與酶輔助相比，物理輔助溶劑提取能節省提取時間，提高蝦青素提取率且方法簡便、成本低。此外，對于黏度大的提取溶劑，例如ILs、DES，采取超聲輔助有利于提高傳質效率，增大HP-AX提取率。

4 展望

近年來，破壁技術和提取技術取得了很大的進展，為雨生紅球藻的有效利用和蝦青素的高效提取提供了新的方法，如脈沖電場法、離子液體法、DES法、雙水相法等破壁提取技術等，但這些研究還處于初步階段，許多基礎科學問題需進一步研究。未來的研究方向將會著力于：① 多種破壁方法結合使用，提高破壁率；② 探索更綠色高效的提取體系，深入研究其提取機理，為工業化生產提供切實可行的理論依據；③ 簡化工藝，將破壁和提取同步進行；④ 提取溶劑的循環利用，有效降低提取成本。