輔助生殖技術中卵母細胞滑面內質網聚集研究進展

姜經航 綜述 江梅 審校

荊門市第二人民醫院生殖醫學中心，湖北 荊門 448000

人類輔助生殖技術為了獲得一定數目的卵母細胞，會使用促排卵藥物，其有可能導致卵細胞周圍微環境的改變，引起卵母細胞的形態變化，進而導致胚胎發育異常。不同于自然周期中卵母細胞核和細胞質成熟是同步的，促排卵周期可能出現不同步，卵母細胞胞漿出現多種形態異常。卵母細胞滑面內質網聚集(aggregates of smooth endoplasmic reticulum，SERa) 就是卵母細胞形態異常的一種。2011 年歐洲人類生殖與胚胎學學會(Alpha/ESHRE)專家共識建議丟棄含有SERa卵母細胞[1]。然而，2015年一項基于歐洲生殖醫學中心的調查數據顯示，只有48%的中心接受2011 年Alpha/ESHRE 共識建議[2]。2017 年Alpha/ESHRE修訂后指出根據病例個體化選擇，再次給出一個模糊處理方式[3]。鑒于對于SERa 的卵母細胞的處理意見不統一，本研究就國內外對含有SERa 卵母細胞的研究進行綜述，為臨床決策提供證據支持。

1 滑面內質網在卵母細胞的結構與功能

滑面內質網(smooth endoplasmic reticulum，SER)是細胞質中最常見的細胞器之一。當受精的精子觸發卵母細胞內游離鈣離子濃度升高，此時胚胎發育就開始了，這是因為儲存在滑面內質網上的Ca2+反復釋放和重新攝取的結果，Ca2+釋放主要由卵母細胞的磷脂酰肌醇信號系統介導[4]。透射電鏡觀察發現，不成熟的卵母細胞中存在滑面內質網管和發育不全的滑面內質網聚集體，而成熟的卵母細胞中，數量最多的細胞器是線粒體-滑面內質網聚集體(mitochondria-SER，M-SER)。M-SER 聚集體直徑從0.5～5 mm不等，被認為是細胞質成熟的標志[5-6]。M-SER聚集體是成熟卵母細胞受精過程中的觸發因素，有助于產生典型的鈣振蕩；可能參與受精和第一次胚胎卵裂時的能量產生和儲存[5-6]。

SERa 就是卵母細胞異常的一種。電鏡檢查發現畸形卵母細胞胞質內含有大量大的滑面內質網和線粒體簇，SERa 大小約為(25.3±6.6)～(26.4±6.4) μm[7-8]，在皮質下也觀察到少數小的SERa，通常被線粒體包圍，這些小的聚集體在倒置顯微鏡下看不到，但是電鏡檢查可以觀察到[9]。超微結構發現大的SERa被異常形狀的線粒體和由非常小的小泡組成的小致密小體所包圍，內部有彎曲的致密小管，在外周較小的SERa中也觀察到相同的病理改變。SERa MⅡ卵母細胞皮質和皮質下主要富含大空泡包裹SER和小SERa[8]，在未受精的卵母細胞、老化的卵母細胞和胚胎中也觀察到。內質網(光滑或粗糙)在卵母細胞或胚胎的應激反應以及對減數分裂紡錘體的調節中起著關鍵作用[8]。線粒體ATP供應平衡是決定卵母細胞受精和胚胎發育能力的關鍵因素之一，在SERa卵母細胞中，存在非典型的鈣釋放模式，這種模式對正常的線粒體呼吸活動和線粒體ATP 的供應平衡產生有深遠的影響。在分子水平研究結果提示在SERa 卵母細胞中，線粒體鈣調節缺陷和能量ATP 動態平衡的紊亂可能會對下游胚胎發育產生負面影響[10-12]。通過采用基因芯片技術比較MⅡSERa 陽性和陰性卵母細胞基因表達譜，生物信息學分析表明，在SERa陽性的卵母細胞中，參與三個主要生物學過程的基因表達顯著下調：(1)細胞分裂和有絲/減數分裂核分裂、紡錘體組裝、染色體分離和有絲分裂細胞周期的G2/M 轉變；(2)參與細胞骨架和微管組織形成；(3)線粒體的結構和活性；從而從分子水平強調SERa的存在與卵母細胞生理改變以及發育能力降低之間可能存在一定聯系[10，12]。

2 SERa形成的原因

導致SERa卵母細胞的分子學機制和細胞活動仍不清楚，不同的因素可能參與了這種畸形的起源，并對臨床結果有不同的影響。卵母細胞SERa的發生率為1.8%～23.1%[11，13-14]。有研究觀察發現SERa 在常規IVF 周期和ICSI 周期中第二極體出現之后，原核出現之前消失，在常規IVF 周期存在時間為(6.16±1.06) h，在ICSI 周期存在時間為(5.43±1.9) h，在受精失敗的卵母細胞內SERa 不會消失[15]。但是因使用顯微鏡的設備不同，胚胎學家的經驗、知識水平以及對SERa的認知深度的不一致，導致SERa 報道的發生率也不盡相同。

2.1 SERa的形成可能與遺傳有關一例28歲女性患者連續三個ICSI 周期中，共獲得59 個均含有SERa MⅡ卵母細胞，三個周期ICSI 受精率分別為80%、50%和42%，但是經過移植以后均無正常新生兒出生[16]；有1例患者連續7個ICSI治療周期，其中有6次出現SERa，移植后均未妊娠[8]，對于SERa陽性周期的患者，在后續再次發生SERa的比例甚至可以達到32%[17]。

2.2 SERa 的形成可能與促排卵激素藥物的使用有關控制性超促排卵時，SERa 陽性周期患者需要更高劑量的促性腺激素(初始和總劑量)以及更長的刺激持續時間[7-8，14-15，18]。但是有些學者持以相反的觀點，他們認為促性腺激素總劑量和刺激時間上并不導致SERa的形成[17，19-22]。在連續三個ICSI周期中促性腺激素的起始量都降低了，但是在后續的治療周期中依舊獲得全部SERa的卵母細胞[16]。也有報道，使用芳香化酶抑制劑促排的患者卵母細胞中SERa的發生率(15.2%)明顯高于使用枸櫞酸克羅米芬促排的患者(6%)[23]。

2.3 SERa的形成可能與體外培養時長有關SERa通常出現在MⅡ期的卵母細胞中，而不是在MⅠ和GV 期的卵母細胞中，并且在分裂中期延長時也會出現。將未受精的卵母細胞繼續培養2～5 d 后，既往無SERa的卵母細胞中會出現SERa。在大SERa和/或小SERa之間可能存在連接，這些潛在的連接可能導致卵母細胞內部SERa進一步增大[11]。在繼續培養過程中，老化卵母細胞可能會發生細胞質異常變化，大于35歲女性的卵母細胞對長期培養更為敏感[24]，SERa最有可能與該異常變化有關[9]。

2.4 SERa的形成可能與促排卵方案有關促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑或拮抗劑來抑制核成熟，GnRH 拮抗劑組SERa 發生率為(4.37±11.62)%，明顯低于GnRH激動劑組的(7.36±17.17)%[25]。長方案所產生的SERa陽性周期明顯多于SERa陰性周期[7]。刺激方案(例如拮抗劑方案、長方案、短方案等)和/或劑量的改變會降低產生優質成熟卵母細胞的可能性，說明刺激方案對卵母細胞SERa 產生有一定的影響[9]。然而有學者卻持有相反的觀點，短方案、長方案以及拮抗劑方案與SERa的產生并無因果關系[17]。

2.5 SERa的形成可能與性激素水平有關芳香化酶抑制劑促排的患者SERa陽性周期的血清雌二醇和孕酮水平均明顯高于SERa陰性周期，枸櫞酸克羅米芬促排的患者中SERa陽性和SERa陰性周期的血清雌二醇和孕酮無差別[23]。有研究提示血清雌二醇[7，9，15，20]和孕酮[15]濃度是顯著變化的，但是有學者卻指出與孕酮水平無顯著相關[9，18，22，26]。基礎狀態下性激素水平在SERa陽性和SERa陰性周期中是無差別的，但是SERa陽性周期促排卵后血清雌二醇水平可升高[18，22，26]，顯著高于SERa 陰性周期[(1 282.2±920.3) pg/mL vs (1 059.0±919.7) pg/mL][7]。單獨使用卵泡刺激素的患者和卵泡刺激素與黃體生成素協同刺激的患者所獲得的卵母細胞在結構和超微結構上存在明顯差異[24]，黃體生成素過早激增可能導致MⅡ卵母細胞中SERa 的形成[11]。同時有研究表明，SERa陽性周期中卵母細胞獲得數據比較多[13，19]。抗繆勒激素濃度較高的患者的SERa 發生率(6.4%)高于正常范圍抗繆勒激素患者的SERa發生率(1.7%)[14]。

3 SERa對受精率以及胚胎發育的影響

SERa卵母細胞中觀察到染色體排列紊亂和/或皮質肌動蛋白完整性喪失，導致細胞骨架異常，可能阻礙第二極體排除或導致受精后卵裂過程中的染色體分離錯誤和干擾細胞質分裂，這對胚胎存活率有明顯的影響[10，12]，并且鈣離子分布模式紊亂導致異常卵裂[11]。含SERa 的卵母細胞在第二極體排出過程中有絲分裂分裂失敗的發生率和減數分裂失敗的發生率均顯著高于不含SERa 卵母細胞，ICSI 周期中減數分裂失敗率更高，有絲分裂的過程中發生卵裂失敗胚胎細胞可能變成四倍體，導致染色體構型異常，卵裂失敗的細胞可能會發育滋養層細胞，導致胎盤形成障礙，SERa 卵母細胞來源的胚胎在形成內細胞團后，內細胞團在分裂的過程中也會發生卵裂失敗，進而可能導致非整倍體發生[11]。

SERa 周期中，卵母細胞正常受精與SERa 直徑呈正相關，單原核、三原核和未受精卵母細胞與SERa直徑無關，胚胎繼續培養后觀察發現，第2天和第3天的胚胎形態不受SERa的影響[14]。SERa的存在能夠顯著降低受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率[20]以及優質胚胎形成率[8-11，14，18，22-23，27]。亞組分析(總MⅡ、正常MⅡ和SERa MⅡ)顯示，SERa MⅡ的受精率受到嚴重影響，明顯低于SERa 陰性卵母細胞，在繼續行囊胚培養時發現，SERa 陽性的卵母細胞來源胚胎發育會受到限制，進入囊胚期的胚胎明顯較少[8，14，21]，SERa導致內細胞團的質量下降35%[28]，囊胚形成率可由62.8%降為42.2%[13]，甚至為無囊胚形成[29]，但是在對形成囊胚進行評分時發現，SERa 的存在并不影響囊胚質量[14]。然而有研究確得出相反的結論，SER 陽性周期第2 天和第5 天更容易得到優質胚胎，囊胚形成率也略勝一籌[17]。也有一些研究證實，SERa 陽性周期的患者受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率以及優質胚胎形成率并無影響[7，13，15，19，21，23，25-26，30]。SERa 陽性周期中卵母細胞Veeck 分級越高，受精率和卵裂率卻與SER 陰性周期越相近[9]。枸櫞酸克羅米芬促排周期SERa 陽性和SERa陰性囊胚形成率卻無差別[23]。在對亞組分析顯示，在SERa陽性周期，SERa陽性MⅡ和SERa陰性MⅡ的受精率、IPN發生率、3PN發生率、以及在第3天和第5天發育成優質胚胎的能力相似[7，13，19，27]。當SERa 陽性MⅡ培養至第5/6天時，常規IVF和ICSI受精方式的不同對受精率、胚胎卵裂率和囊胚率也無影響[15]。

4 SERa對妊娠結局的影響

如果遵循2011 年Alpha/ESHRE 共識，將SERa 卵母細胞丟棄，可利用卵母細胞數量減少，部分患者無可利用胚胎，導致周期取消率增加，從而降低卵子數量有限的夫婦受孕的機會。周期取消率與血清卵泡刺激素水平和SERa 卵母細胞數呈顯著正相關，在對獲得卵子數進行分層分析發現，獲得卵子數為1～5 個周期取消率最高[31]。

后代的表型在很大程度上取決于卵母細胞的質量，SERa 卵母細胞具有高非整倍體率(18%～37%)[28]。大SERa的出現表明細胞質是病理性的，胚胎發育、胚胎種植以及臨床預后下降和新生兒畸形均與SERa有關，移植SERa陽性的卵母細胞來源的胚胎以后，種植率可降低40%[19]，妊娠率下降67%，生化妊娠率明顯升高[9]，流產率增加20%[32]，但是抱嬰回家率呈現一種相反的變化趨勢[14]，即使是來自同一周期的SERa陰性的卵母細胞受孕機會也較低[9，19]，因此不建議SERa 的卵母細胞來源的胚胎用于移植[8]。

并非所有的研究都指出SERa的存在對妊娠結局不利。在玻璃化冷凍囊胚移植周期中，SERa陽性MⅡ在IVF和ICSI中的臨床妊娠率沒有顯著差異，進一步Logistic 回歸分析中，SERa 的存在與持續妊娠率之間沒有顯著關聯(95%CI：0.505～1.963)[15]。在芳香化酶抑制劑和枸櫞酸克羅米芬促排的患者SERa 陽性和SERa 陰性周期之間，在胚胎種植率、流產率以及活產率沒有發現顯著差異[23]。同時對于SERa 陽性周期的患者，無論是β-HCG 陽性的數量，還是臨床妊娠率和流產率、種植率都沒有顯著減少[7，9，14，18-19，21，26，30]，但是隨著含SERa 陽性卵母細胞比例的增加，活產率逐漸降低，含SERa 陽性卵母細胞比例大于50%時無活產胎兒出生[30]。在SERa 陽性周期中亞組分析顯示，SERa陽性MⅡ卵母細胞妊娠率雖然低于SERa陰性MⅡ卵母細胞，但差異無統計學意義，流產率或活產率在兩者之間無區別[7]。單純SERa 陽性MⅡ卵母細胞來源胚胎移植(31例)、單純SERa陰性MⅡ卵母細胞來源胚胎移植(235 例)和混合性胚胎移植(98 例)的妊娠率(25.8%、37.4% 和41.8%)、種植率(18.9%、17.4% 和13.1%)和臨床妊娠率(22.6%、32.4%和37.9%)無明顯差異[13]。但是也有研究指出SERa 卵母細胞形成的優質胚胎率明顯降低[26]。SERa-MⅡ例數最少，但是異位妊娠率較高，卻沒有顯著差異[8]。

5 SERa對新生兒結局的影響

有研究報道指出，SERa陽性周期中有386例新生兒出生，并詳細記錄這些新生兒情況，有364例健康新生兒，而22例孕婦發生了圍產期并發癥，這些并發癥包括10例活產畸形，4例新生兒死亡，2例死產和6例終止妊娠；其中48例來自SERa陽性MⅡ卵母細胞來源胚胎移植，1例活產畸形，1例新生兒死亡，1例死產和1例終止妊娠；另有53例健康新生兒來源于混合移植，并伴有7例圍產期并發癥[33]。以上畸形主要表現為：膈疝、三體(47XY+21)綜合征、重復腎、尿道下裂、心血管畸形、臂癱以及Beckwith-Wiedemann 綜合征等[8-9，13-14，16，33-34]。SERa陽性和陰性周期新生兒畸形率無區別[7，14-15，18，21，23，30]，但是隨著含SERa 陽性卵母細胞比例的增加，活產率逐漸降低，含SERa 陽性卵母細胞比例大于50%時無活產胎兒出生[30]。SERa的患者妊娠期產科并發癥比例相對較高，更容易出現早產，但是出生的新生兒體質量也明顯降低[7，，14]，妊娠期較短[7]，但有研究卻發現妊娠周數、新生兒體質量以及身長無差別[13，15，21]。

卵母細胞的安全性進行更多的流行病學研究，尤其有必要評估出生時和后期發育期間的畸形發生情況，SERa 作為預測臨床結局的結論的研究樣本量尚少，并且不同的研究結果之間存在一定的爭議，SERa和胎兒畸形之間是否真的存在關聯尚不清楚，但是也有可能存在失訪漏報的可能性。

6 結語

2011年Alpha/ESHRE專家共識，強烈建議不要對受影響的卵母細胞進行授精，歐洲部分生殖中心調查結果顯示，47.5%的生殖中心對SERa卵母細胞的管理政策接受Alpha/ESHRE 共識建議，然而只有大約13.8%的中心丟棄SERa 卵母細胞；42.5%的中心不會丟棄SERa卵母細胞，但會對移植SERa周期的胚胎和新生兒進行追蹤隨訪；24.4%的中心在孕期會制定專門的妊娠監測。大約25%的中心會和患者溝通這種卵母細胞畸形，無論是丟棄還是移植，均應該獲得患者知情并簽署同書以后才能繼續后續醫療行為[2]。鑒于目前研究有正常新生兒出生，特別是卵子數量有限的夫婦如若遵循該共識，會增加周期取消率，2017 年Alpha/ESHRE 再次提出專家共識，與患者充分溝通，正確地告知患者出生畸形的風險，以及不移植所導致妊娠機會降低，個體化處理[3]。

因此，本研究指出SERa 卵母細胞在輔助生殖技術中有一定的發生率。目前，對于該卵母細胞是否行體外受精意見尚不統一。就目前移植SERa卵母細胞來源的胚胎的研究數據而言，有健康新生兒出生，這些文獻數據支持給予學者以及患者信心。臨床上，丟棄SERa卵母細胞，可能是一種不合理的處理策略，應該讓這些卵母細胞受精，繼續發育成具有可利用價值的胚胎，避免了卵母細胞的浪費。再無其他適合移植的胚胎時，酌情考慮選擇SERa卵母細胞來源的胚胎進行移植前。但應當充分告知患者，幫助其進行移植決策，且必須嚴格追蹤胎兒情況以及密切隨訪觀察新生兒的成長發育。對于卵母細胞SERa形成原因我們生殖工作者應該繼續深入研究其機制，為臨床避免SERa尋找一種治療策略，改善不孕癥患者的臨床結局。