牙齦卟啉單胞菌雙組分信號轉導系統(tǒng)的研究進展

堯可 蔡靖儀 趙蕾 吳亞菲 趙志河 申道南

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院，成都610041

牙齦卟啉單胞菌作為導致慢性牙周炎的主要病原菌，與心血管疾病、糖尿病、阿爾茲海默癥等全身系統(tǒng)性疾病密切相關[1]。面對宿主及口腔內(nèi)如pH、溫度、滲透壓、氧化應激、營養(yǎng)物質(zhì)、抗生素等復雜的生存環(huán)境，牙齦卟啉單胞菌需要靈敏地感知其變化并快速作出調(diào)整才能得以生存，并發(fā)揮毒力作用。這種適應能力一定程度上依靠細菌的雙組分信號轉導系統(tǒng)（two-component signal transduction system，TCS）[2]。TCS使細菌能夠感知、響應和適應各種環(huán)境變化。TCS 可調(diào)節(jié)細菌入侵、生物膜形成、趨化作用、脂多糖合成和抗生素耐受等多種與細菌致病性相關的基因的表達[3-6]。此外，TCS 亦可調(diào)節(jié)細菌自身生長、分裂、代謝等多方面活動[7]。

近年來，有關牙齦卟啉單胞菌TCS 的研究逐漸被報道，本文擬對當前關于牙齦卟啉單胞菌的TCS的研究進行綜述[8-10]。

1 TCS及其在牙齦卟啉單胞菌中的概況

TCS 廣泛存在于多種生物體內(nèi)，但在革蘭陰性菌中最為常見。一種細菌可擁有多種不同類型的TCS，其結構不盡相同，隨感受的刺激信號和作用的目標基因不同而有所變化。不同細菌內(nèi)TCS 的數(shù)目也有所不同，其數(shù)值與基因組的大小和所處生態(tài)位的多樣性有關[11-12]。

結構上，典型的TCS 通常包括一個組氨酸激酶（histidine kinase，HK）和反應調(diào)節(jié)蛋白（response regulator protein，RR）。HK 通常是含有組氨酸磷酸轉移結構域和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結合結構域的同型二聚體，主要由胞外感應器、跨膜區(qū)、胞內(nèi)連接區(qū)、激酶結構域和ATP 結合區(qū)組成。其中，激酶結構域即二聚和組氨酸磷酸轉移酶（dimerization and histidine phosphotransfer，DHp） 結 構 域[13]。DHp結構域含有一個保守組氨酸殘基，可接受和傳遞磷酸基團[14]。RR 則含有一個接受結構域和一個效應結構域，接受結構域含有一個保守的天冬氨酸殘基，可接受來自HK的磷酸基團。亦有約50%的RR 僅有一個結構域，同時發(fā)揮接受磷酸基團和調(diào)節(jié)下游分子的作用[15]。

除了上述典型HK 外，還有一種含有一個起磷酸轉移作用的接收結構域的混合型HK[14]。部分混合型HK 還含有一個組氨酸磷酸轉移酶結構域。另外，部分RR 亦含有HK 結構域，稱之為混合型RR[16-17]。通常，編碼感應蛋白HK 的基因和編碼其同源RR 以及其它輔助成分的基因同屬一個操縱子。但是仍有部分HK 或RR 編碼基因單獨存在，缺少其相對應的RR 或者HK 編碼基因。這類單獨存在的HK或者RR被稱為“孤兒”組件[16]。

功能上，細菌HK 通過其位于胞外的N 端感應結構域在檢測到細胞外環(huán)境的特定變化后，其ATP 結構域結合ATP，并將其磷酸基團傳遞至DHp 結構域中保守的組氨酸殘基實現(xiàn)自身磷酸化反應。然后，同源RR 催化磷酸基團轉移至RR 的接收結構域上的天冬氨酸殘基。這通常會觸發(fā)構象變化激活RR 的效應結構域，進而激活（或抑制）靶基因的表達來產(chǎn)生相應的細胞反應[14]。另外，部分RR 亦可直接結合RNA 或者蛋白質(zhì)，甚至通過自身的酶活性發(fā)揮作用[7]。激活的RR 則可通過HK 的磷酸酶活性、自身去磷酸化作用或者磷酸酶輔助的去磷酸化作用回到基態(tài)水平[7]。反應調(diào)節(jié)蛋白的總體磷酸化水平最終控制其活性。

在齦下菌斑內(nèi)，牙齦卟啉單胞菌不僅需要面對復雜多變的環(huán)境，還要應對包括宿主的免疫防御體系，以及生物膜中其他微生物產(chǎn)生的代謝物等的挑戰(zhàn)。依此推定牙齦卟啉單胞菌的各個雙組分信號轉導系統(tǒng)在其生存和發(fā)揮毒力中的具有重要調(diào)控作用。目前研究已知，牙齦卟啉單胞菌的ATCC33277 菌株含有5 對完整的TCS 和2 種“孤兒”成分，W83 菌株則含有4 對完整TCS 和4 種“孤兒”成分[8-10]。相對于其他革蘭陰性細菌，牙齦卟啉單胞菌的TCS 數(shù)量相對較少，一方面，這可能與其專性厭氧的嚴苛生存條件有關，有相對局限的特定定植部位；另一方面也可能與細菌進化相關，預示著其不同雙組分信號轉導系統(tǒng)相互之間以及與其他系統(tǒng)之間可能存在著復雜的交互調(diào)控作用，牙齦卟啉單胞菌通過組成簡單但高效的信號轉導系統(tǒng)來調(diào)節(jié)基因表達以應對特定的挑戰(zhàn)。接下來，筆者將對目前研究較多的牙齦卟啉單胞菌TCS，即FimS/FimR、HaeS/HaeR、PorX/PorY、GppX、RprY系統(tǒng)的組成和功能進行闡述。

2 FimS/FimR

FimS/FimR TCS 在ATCC33277 和W83 菌 株 中分別 由PGN_0904/PGN_0903 和PG1432/PG1431 編碼。作為牙齦卟啉單胞菌中研究最為深入的TCS，其組氨酸激酶FimS 和反應調(diào)節(jié)蛋白FimR 最早由Hayashi 等[18]在轉位子誘導的菌毛缺陷變異株中發(fā)現(xiàn)。FimS和FimR的基因位于不同的操縱子，預示著他們可能與其他HK或RR存在著交叉調(diào)控作用，以增加其對復雜的環(huán)境變化的適應性。Lo 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抑制基因fimS 的表達導致牙齦卟啉單胞菌的10%的基因表達變化。而相比之下，Nishikawa 等[20]發(fā)現(xiàn)fimR 基因缺陷菌株僅影響7 種基因的表達。這表明FimS 和FimR 之間不是簡單的線性關系，而與其他系統(tǒng)或分子存在著復雜的交互作用。

Nishikawa 等[21]通過比較ATCC33277 菌株以及天然的菌毛缺陷株W83 發(fā)現(xiàn)，天然菌毛缺陷株W83 中的FimS 缺乏激酶結構域，因而不能結合ATP 發(fā)揮磷酸化作用。所以該菌株內(nèi)雖然有fimA基因，但卻沒有fimA 轉錄物或FimA 蛋白。在ATCC33277 菌株中，F(xiàn)imS/FimR TCS 可影響牙齦卟啉單胞菌菌毛和生物膜的形成[19-22]。牙齦卟啉單胞菌表面主要有2 種不同的菌毛[23-24]。長菌毛由fimA 基因編碼的蛋白亞基FimA 組成，短菌毛由一大小為67 kg·mol-1蛋白Mfa1構成。2種菌毛均為細菌生物膜形成所必須，且都與致病性密切相關[25]。一方面，F(xiàn)imS/FimR TCS 與FimA 的功能密切相關，fimS/fimR 基因表達缺陷將導致fim 基因簇和FimA 等蛋白表達量顯著下降[18,21]。而通過質(zhì)粒轉染技術向fimR 基因缺陷變異株中引入fimR 基因，則可恢復FimR 和FimA 蛋白和細菌表面菌毛的表達[26]。

Nishikawa 等[20]進一步探究了其作用的分子機制后發(fā)現(xiàn)，活化的FimR 并不是直接結合到fimA基因的啟動子，而是通過結合至fim 基因簇中第一個基因fimX 的啟動子區(qū)域發(fā)揮作用，fimX 才是FimR 蛋白的目標基因，其產(chǎn)物還可反過來進一步調(diào)節(jié)包括fimA 在內(nèi)的fim 基因簇的基因表達。另一方面，Wu 等[22]的研究顯示：mfa1 基因表達也與FimS/FimR TCS 的調(diào)節(jié)相關，但與長菌毛的調(diào)控不同的是，F(xiàn)imR 直接與mfa1基因的啟動子結合發(fā)揮作用。

3 HaeS/HaeR

HaeS/HaeR由PGN_0752/PGN0753（ATCC33277菌株）或PG0719/PG0720（W83 菌株）編碼。ATCC33277菌株的PGN_0752基因存在天然的缺失突變，相應的HK 和RR 的表達均顯著降低，導致細菌的生長相對緩慢。

Mattos-Graner等[27]通過染色質(zhì)免疫沉淀芯片技術初步確定HaeS/HaeR 編碼的TCS 參與牙齦卟啉單胞菌鐵/血紅素獲得相關基因的調(diào)控。含鐵血紅素是牙齦卟啉單胞菌生存的必需營養(yǎng)素之一，Scott等[28]檢測到HaeR 可結合并調(diào)節(jié)細菌與獲取含鐵血紅素、轉運離子等生物過程相關的基因，同時發(fā)現(xiàn)HaeR 的生物學功能受含鐵血紅素濃度和目標基因的影響，可在不同條件下促進或抑制相關基因的表達。

當含鐵血紅素濃度升高時，HaeR與PGN_0704（ihtA）、PGN_0687（htrA）和PGN_0556（hmuS）三者上游非編碼區(qū)域結合促進其轉錄，發(fā)揮正向調(diào)控作用，而對TonB 依賴的受體、ABC 轉運蛋白和RgpA、Kpg 的表達發(fā)揮負向調(diào)控作用[28]。由此可知，當含鐵血紅素濃度較低時，HaeS 的胞質(zhì)外結構域與血紅素親和力增強，促進與細菌獲取血紅素相關的酶和轉運蛋白的生成，而當含鐵血紅素充足時，兩者親和力降低，以控制HaeR活性。

4 PorX/PorY

PorX/PorY的HK是PorY（ATCC33277：PGN_2001，W83：PG0052），而RR是PorX（ATCC33277：PGN_1019，W83：PG0928）。PorX/PorY TCS可通過影響Ⅸ型分泌系統(tǒng)（type Ⅸsecretion system，T9SS）的功能調(diào)節(jié)牙齦素等物質(zhì)的分泌。T9SS 是存在于纖維桿菌-綠菌-擬桿菌超門細菌中的一種革蘭陰性菌蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)的跨細胞外膜分泌過程中發(fā)揮著重要作用[29]。T9SS 被證明可促進牙齦卟啉單胞菌中的牙齦素和肽?；彼崦搧啺访福╬eptidylarginine deiminase，PAD）的釋放[30-31]。在牙齦卟啉單胞菌ATCC33277 菌株中，通過蛋白組學研究等方法，研究者共鑒定出包括porX和porY在內(nèi)的11種參與牙齦素和PAD胞膜轉運的por基因[31-34]。其中，PorX和PorY組成的雙組分系統(tǒng)可調(diào)節(jié)其他por 基因的表達。Sato等[31]通過基因芯片分析表明，相比于野生型菌株，porX 和porY 基因變異株細菌中20 種基因表達量下降了超過40%，其中包括與牙齦素分泌相關的porT、porK、porL、porM、porN、porP 和sov 等T9SS 相關基因。Kadowaki等[35]進一步發(fā)現(xiàn)，在Mn2+存在條件下，PorY 將磷酸基團轉移至PorX，活化的PorX 與胞質(zhì)外功能sigma 因子SigP 直接作用，而后SigP 與編碼T9SS 系統(tǒng)組分的基因的啟動子結合，調(diào)節(jié)T9SS 組分基因表達過程。另外，Vincent等[36]運用凝膠電泳遷移實驗等發(fā)現(xiàn)，PorX 并未與T9SS基因啟動子結合直接調(diào)節(jié)T9SS基因表達，而是與T9SS跨膜復合體組分之一的PorL蛋白的胞質(zhì)內(nèi)的疏水結構域結合。因而PorX對T9SS中分子的調(diào)控作用有可能是間接調(diào)控。

5 GppX

牙齦卟啉單胞菌中存在一種混合型TCS，其組胺酸激酶和反應調(diào)節(jié)結構域共同存在于由961個氨基酸組成的GppX蛋白質(zhì)（PGN_1768或PG1797）中。據(jù)推測，GppX 蛋白含有一個嵌入胞膜的N 端感應激酶結構域和一個含有螺旋-轉角-螺旋模體的C 端反應調(diào)節(jié)結構域[37]。Hasegawa 等[37]最早發(fā)現(xiàn)，GppX 與牙齦卟啉單胞菌牙齦素的成熟和定位以及色素生成有關，gppX 基因變異株的rgpA、rgpB 和kgp 基因表達雖然在轉錄水平上與野生型菌株相當，但牙齦素的活性卻相對較低，并且多位于培養(yǎng)基上清液中而非胞內(nèi)，另外突變株的細菌菌落也缺乏特征性的色素沉著。James 等[38]發(fā)現(xiàn)，GppX 還可通過調(diào)節(jié)luxS 基因表達來影響牙齦卟啉單胞菌對氯化血紅素和礦物離子的攝取以及Kpg 的表達，在gppX 變異株中，luxS 基因的表達量是野生型菌株的2 倍以上，TonB 連接的血紅素結合蛋白Tlr和HmuR的基因表達則分別上調(diào)3倍和下降5倍左右。通過對luxS 變異株RNA 進行測序，Hirano等[39]證實了luxS 對包括hmuR 在內(nèi)的57 種基因的調(diào)控作用。然后，Hirano等[40]再次通過RNA 測序的方法，發(fā)現(xiàn)gppX 變異株共有53 種基因上調(diào)，37種基因下調(diào)；研究人員進一步研究了GppX對基因PGN_0151 的作用發(fā)現(xiàn)，GppX 可直接結合到與PGN_0151 共同轉錄的基因PGN_0152 的啟動子上促進二者轉錄，且GppX-PGN_0151 調(diào)節(jié)子和細菌的生物膜形成密切相關，與野生型細菌相比，gppX 和PGN_0151 變異株形成生物膜的能力均明顯下降。

6 RprY

在脆弱擬桿菌和其他擬桿菌門菌如中間普雷沃菌和福賽斯坦納菌中，rprY 和其同源HK 基因rprX 相鄰。但與其他細菌中不同的是，牙齦卟啉單胞菌中的RprY 是一種“孤兒”RR，缺乏一般TCS 中的同源HK，由PGN_1186（ATCC 33277）或者PG1089（W83）基因編碼。最近Li 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌為彌補RprX 的缺失，通過乙?；饔脕碚{(diào)節(jié)RprY的活性，而乙?；腞prY結合目標DNA的能力也因此發(fā)生變化。

Duran-Pinedo等[42]通過比較rprY 變異株和野生型牙齦卟啉單胞菌的基因表達發(fā)現(xiàn)，RprY 主要參與細菌兩方面活動的調(diào)節(jié)：轉運功能和氧化應激；Na+轉運還原型輔酶Ⅰ-泛醌氧化還原酶（nicotinamide adenine dinucleotide:ubiquinone oxidoreductase，NQR）基因表達在野生型菌株中是變異株的4倍，而外排泵和氨基酸轉運蛋白、過氧化物歧化酶等基因在變異株中則被激活。進一步Krishnan等[43]研究發(fā)現(xiàn)，rprY 變異株在Na+缺乏的培養(yǎng)基中生長受到限制，同時Na+缺乏的環(huán)境可引起牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生較強的氧化應激，而RprY 作為一種抑制分子，可通過與過氧化氫酶或熱休克蛋白等分子伴侶的基因，如groES、clpB、dnaK等直接結合調(diào)節(jié)細菌氧化應激反應；該實驗同時表明，RprY 亦可結合至自身基因，發(fā)揮自我調(diào)節(jié)作用。關于RprY 的其他研究[44]顯示，RprY 還可與編碼NQR 操縱子內(nèi)第一個基因nqrA 的啟動子結合，參與牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)能過程。并且Lewis等[45]發(fā)現(xiàn)，在亞硝酸鹽刺激下，牙齦卟啉單胞菌的rprY基因表達也存在上調(diào)，提示RprY 可能參與了牙齦卟啉單胞菌的更多生命活動。

7 其他

ATCC33277 菌株中還有2 個完整的TCS 系統(tǒng)PGN_0012/0013和PGN_0774/0775，目前鮮有研究對其進行報道，研究者[46]通過轉座子高通量測序發(fā)現(xiàn)，PGN_0012 的突變體在小鼠腹腔膿腫模型中表現(xiàn)出極低的適應性。對2個系統(tǒng)的功能基團進行搜索后發(fā)現(xiàn)，2 組TCS 都屬于NtrC 家族，該家族在其他革蘭陰性菌中被報告與Ⅲ型分泌系統(tǒng)信號轉導組分的調(diào)節(jié)相關[47]。目前關于該TCS 的研究尚處于早期階段，關于其調(diào)控作用仍需更多的研究來拓展。

8 問題和展望

牙齦卟啉單胞菌在牙周炎和相關全身系統(tǒng)性疾病中的作用已得到公認，雙組分信號轉導系統(tǒng)在牙齦卟啉單胞菌的自身調(diào)控和致病性中扮演著極為重要的角色。目前國內(nèi)外關于牙齦卟啉單胞菌的TCS 的研究報道相對有限，導致學界對牙齦卟啉單胞菌的TCS 的結構、功能和機制認識尚有不足。本綜述可為牙齦卟啉單胞菌的相關研究提供更多思路，也能對臨床預防和治療工作有所啟發(fā)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。