一株暗褐網柄牛肝菌的分離與培養基優化

HASSAN Sidik Mohamed，郭旭新，吳崢妍，潘晨晨，徐孟濤，柳永,2,3*

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023;3.浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江 杭州 310023)

暗褐網柄牛肝菌[Phlebopusportentosus(Berk.& Broome)Boedi jn.]俗稱黑牛肝菌，屬小牛肝菌科(Boletinellaceae)脈柄牛肝菌屬(Phlebopus)可食用真菌[1]，味道鮮美、價格昂貴。自然條件下，暗褐網柄牛肝菌可與鳳凰木、菠蘿蜜、柚子、咖啡等多種植物形成外生菌根[2]。弱酸性(均值6.04)和高速效鉀土壤(均值231.17 mg·kg-1)有利于暗褐網柄牛肝菌出菇[3]。人工平板菌絲培養條件下，葡萄糖、酵母膏、KH2PO4和MgSO4分別是暗褐網柄牛肝菌的最適碳源、氮源和無機鹽[4]；深層液態培養條件下甘露醇和酵母膏分別為其最適碳源和氮源[5]。暗褐網柄牛肝菌生產母種優選培養基為添加1.0 g·L-1MgSO4、1.0 g·L-1KH2PO4和2.0 g·L-1酵母膏的改良PDA培養基[6]，但繼代次數不宜超過2次[7]。

國內人工栽培研究表明，在穩定的栽培模式下，袋栽暗褐網柄牛肝菌鮮品產量可達100 g·袋-1，出菇周期60 d左右。出菇后的廢菌渣可于林下仿生栽培，第2年每667 m2產鮮菇60 kg左右[8]。人工覆土以全碳、總磷較高的菜園土為佳，出菇數量和單菇質量均得到顯著提高[9]。泰國Kumla等[10]和Sanmee等[11]分別以高粱粉-宿主營養液-草粉和橡膠樹粉-米糠等復配物料實現了暗褐網柄牛肝菌成功出菇，但離產業化應用尚遠。

大量菌根菌與宿主植物通過“碳水化合物和磷交易”的方式實現互利共生，在森林地下碳水化合物和磷的運輸與交換中發揮著重要作用[12]。同時，菌根菌是13C標記光合產物的首要受體，且6 d后系統內剩余13C標記光合作用產物中的26.8%被轉移到地下[13]。作為外生菌根菌家族的一員，暗褐網柄牛肝菌極有可能在自然界中扮演著相似的角色，與宿主植物間擁有豐富的互動[14]。在從宿主獲取營養物質的同時，暗褐網柄牛肝菌如何感知季節的變化，進而完成子實體發育呢？植物體內伴隨季節波動的激素水平，是否可能為暗褐網柄牛肝菌感知適宜繁殖季節的到來提供“信號”呢？本文介紹了暗褐網柄牛肝菌對幾種常見天然營養物和植物生長調節劑的響應性測試結果，希望能為后續暗褐網柄牛肝菌的栽培應用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

暗褐網柄牛肝菌子實體采自云南省木水花野生菌批發市場(昆明市)，PDA培養基購自杭州百思生物公司，全土豆粉購自甘肅正陽農業科技公司，酵母抽提物購自OXOID公司，小牛浸膏購自杭州微生物試劑有限公司，活性炭購自中國醫藥集團有限公司，鮮蛋黃為市售鮮雞蛋的蛋黃，小麥麩皮、花生秸稈粉、毛竹粉、楊木屑分別來自安徽省淮南市、山東省萊蕪市、浙江省安吉縣和江蘇省連云港市。MgSO4、KH2PO4、維生素B1(VB1)、葡萄糖、無水乙醇等均為國產分析純，瓊脂粉購自天津致遠化學試劑公司。脫落酸(ABA)、細胞分裂素類植物生長調節劑6-BA、生長素類植物生長調節劑2,4-D均為Sigma公司產品。

1.2 暗褐網柄牛肝菌菌種分離與鑒定

取暗褐網柄牛肝菌子實體1個，用75%乙醇棉擦拭表面后，切開菌柄，從斷面處挖取組織小塊，接種于改良PDA培養基上，于28 ℃培養15 d左右即可獲得分離株。改良PDA培養基配方：PDA粉末 46.1 g·L-1，全土豆粉30 g·L-1，硫酸鎂1.5 g·L-1，磷酸二氫鉀3 g·L-1，VB110 mg·L-1，瓊脂10 g·L-1，pH 6.8。121 ℃高壓滅菌30 min，倒平板備用。分離株采用ITS序列對比法進行分子鑒定，DNA提取方法為FDEB法[15]。ITS擴增引物為ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min，16 ℃保溫。PCR擴增產物經測序后提交NCBI網站進行BLASTn序列比對，選取相似度99%以上序列的菌種信息作為分離株物種鑒定結果。

1.3 天然物料對暗褐網柄牛肝菌分離株生長速度的影響

選取長勢健壯的暗褐網柄牛肝菌分離株DN18開展后續生長性能研究。DN18在改良PDA培養基上生長緩慢，推測可能與缺乏某種營養成分有關。在改良PDA培養基基礎上，分別添加6 g·L-1酵母抽提物(PDY)、小牛浸膏(PDB)、活性炭(PDC)、鮮蛋黃(PDE)、小麥麩皮(PDF)、花生秸稈粉(PDG)、毛竹粉(PDM)和楊木屑(PDW)，配制成8種固體培養基。接種DN18菌種后于28 ℃培養28 d，觀察暗褐網柄牛肝菌長勢。

1.4 6-BA、ABA、2,4-D對菌絲長勢的影響

在固體改良PDA培養基中，分別添加2、3、5 mg·L-1的6-BA、ABA或2,4-D。各處理制備5個固體培養基，每個培養皿中培養基量約為20 mL。接種DN18后于28 ℃培養28 d，測量和統計各平皿中DN18菌落直徑和菌囊數量，計算平均值。

1.5 植物生長調節劑對菌絲長勢的影響

在改良固體PDA培養基中，分別添加不同比例的6-BA和2,4-D或6-BA和ABA，6-BA與2,4-D或ABA的質量比分別為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1。其中，6-BA質量體積分數固定為4 mg·L-1，根據比例關系分別添加適量2,4-D或ABA。菌絲生長速度測定和菌囊數量統計方法同1.4節所述。

2 結果與分析

2.1 暗褐網柄牛肝菌分離株鑒定

暗褐網柄牛肝菌組織分離與ITS序列擴增結果見圖1。圖1中，A為暗褐網柄牛肝菌子實體外觀與橫切面； B圖中箭頭所示為子實體根部的菌囊樣結構，可能與子實體分化有關，后續培養基篩選中把菌囊形成數量納入考量指標之一；C圖為DN18分離株，其生長旺盛，菌落邊緣整齊；D圖中M1為DNA分子質量標準DL 15 000，1號泳道是基因組DNA提取結果，條帶規則，無明顯拖尾，提取效果良好；E圖中4號為DN18 ITS擴增產物，條帶單一明亮，大小介于500～800 bp。測序結果與Genbank收錄的暗褐網柄牛肝菌的ITS序列具有99%相似度，判斷分離株DN18為暗褐網柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)。

A為暗褐網柄牛肝菌子實體外觀與橫切面； B圖中箭頭所示為子實體根部的菌囊樣結構；C圖為DN18分離株；D圖中M1為DNA分子量標準DL 15 000，1號泳道是基因組DNA提取結果；E圖中4號為DN18 ITS擴增產物。圖1 暗褐網柄牛肝菌組織分離株及其ITS序列擴增產物

2.2 添加物對DN18長勢的影響

改良PDA培養基中額外添加活性炭、花生秸稈粉、酵母抽提物、鮮蛋黃、毛竹粉、小牛浸膏、小麥麩皮和楊木屑后，DN18菌落外觀見圖2。從圖2可以看出，9種培養基上DN18的生長速度和菌落顏色等均有一定差異。生長速度方面，PDW=PDG>PDM=PDB>PDF>PDC>改良PDA=PDE>PDY；菌落顏色方面，PDF、PDG、PDW培養基上DN18菌落顏色均呈暗褐色；PDM培養基上，菌落中部呈深褐色，外圍顏色仍為黃色；其他培養基上菌落顏色以黃色為主。

PDY、PDB、PDC、PDE、PDF、PDG、PDM、PDW分別為添加酵母抽提物、小牛浸膏、活性炭、鮮蛋黃、小麥麩皮、花生秸稈粉、毛竹粉和楊木屑的改良PDA培養基。圖2 DN18在9個培養基上的菌落形貌

2.3 單一植物生長調節劑對DN18長勢的影響

DN18在添加植物激素培養基上的生長速度和菌囊數量統計結果見表1，菌落形態見圖3。從表1可以看出：添加2、3、5 mg·L-1ABA未表現出促進DN18生長的效應；6-BA和2,4-D促進了DN18菌絲體生長，尤其5 mg·L-12,4-D和3 mg·L-16-BA促進DN18生長效應較為突出。5 mg·L-12,4-D較無激素對照(改良PDA培養基)生長速度提高了37.3%。此外，添加6-BA和2,4-D對菌落顏色有一定影響，添加濃度越高，菌落顏色越深(圖3)。

表1 3種外源激素處理下DN18長勢

圖3 DN18在不同植物激素培養基上的菌落形態

從表2和圖4可以看出，6-BA、2,4-D質量比為1∶1時，DN18生長速度快于其他處理組，與單獨添加5 mg·L-12,4-D效果相當。6-BA、ABA質量比為4∶1、8∶1時，菌囊數量明顯增多。菌絲生長速度與菌囊數量沒有明顯關聯，菌囊的生物學意義還有待后續挖掘。

表2 DN18在混合植物激素培養基上的生長情況

3 討論

對比PDF和PDG培養基成分可以發現，PDF中小麥麩皮蛋白質含量(12%～18%)[16]高于PDG中花生秸稈蛋白質含量(6.6%～11.6%)，PDF中非淀粉多糖含量(46%左右)[17]低于PDG中花生秸稈的中性與酸性洗滌纖維含量(65%～81%)[18]。結合DN18在富含蛋白質營養的PDY和PDB培養基上的長勢，可以推測蛋白質并非DN18在改良PDA培養基上生長的主要限制營養因子。厚壁毛竹中棕纖維含量約為46%～56%[19]，均低于花生秸稈粉和楊木屑的蛋白質含量[20]，但與小麥麩皮中較低的非淀粉多糖含量(46%左右)接近，由此推測，導致菌落顏色呈暗褐色的因素可能是非淀粉多糖中的某一類組分。從圖3中5 mg·L-16-BA、3 mg·L-1ABA、5 mg·L-12,4-D與其他處理的菌落顏色差異，以及圖4中6-BA、BA質量比2∶1處理突出的深褐色菌落可以發現，DN18的菌落顏色與激素水平有關。同時大量研究表明，在菌根菌與其宿主植物間的共生關系中，激素調控扮演著極為重要的作用。一方面，外生菌根真菌可以產生吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)和細胞分裂素等植物激素[21]，在菌根共生關系形成過程中，對植物根部的發育產生影響。另一方面，菌根菌的生長特性也受到植物激素的調控：GAs在菌根共生關系建立中扮演負調控因子，外源施加活性GA3時，叢植菌根菌的分支減少；ABA在低濃度下促進菌根菌在植物根部的定殖，高濃度下同樣具有降低叢枝菌根菌分支數量的效應。在楊樹和番茄外生菌根菌研究中發現，菌根真菌能誘導根尖生長素的累積，菌根和生長素共同調控植物的生長發育[22]。當前的菌根共生關系研究中，默認以植物為中心研究對象，作為地下物質交換中心的菌根菌則被忽視，植物激素對菌根菌生長發育的影響鮮有研究。菌根類食用菌分離難、栽培難或許就與栽培介質中缺乏某些重要植物源活性因子有關。

圖4 DN18在混合植物激素培養基上的菌落形態