山羊p300基因生物信息學(xué)分析及其在主要器官中的表達(dá)

李曉璇，童旭,2，張丹丹,2，張冰，申屠璐燕,2，孫夢娟,2，齊昕,2，寧偉,2，張運海,2，曹祖兵,2*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2.地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

山羊是最早被馴化的家畜之一，其繁殖力高、適應(yīng)性強。近年來，我國山羊飼養(yǎng)業(yè)蓬勃發(fā)展，其中乳用型山羊可以提供高質(zhì)量高品質(zhì)的奶制品，肉用型山羊可以提供優(yōu)質(zhì)羊肉，絨用型山羊則可以提供優(yōu)良的絨產(chǎn)品。近年來，隨著人民生活水平的逐步提高，對肉用型山羊的需求量日益增加，這就需要提高肉用型山羊的生產(chǎn)力。同時，在提高肉用型山羊生產(chǎn)力的過程中，必須確保山羊的正常生長發(fā)育，這樣才能獲得更多數(shù)量的肉用型山羊。

與山羊生長發(fā)育的相關(guān)基因有很多，其作用也各不相同[1]。比如：KDM6 A基因會調(diào)節(jié)生育力、成骨分化和骨骼發(fā)育不良[2-5]；FGF10基因在調(diào)節(jié)山羊肌肉前脂肪細(xì)胞的成脂分化中起重要作用，最終會影響羊肉的品質(zhì)[6]。p300又稱EP300或KAT3B，因其相對分子質(zhì)量約300 ku，故命名為p300[7]，其結(jié)構(gòu)中含有組蛋白乙酰化區(qū)，具有乙酰化活性，可作為一類組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，能乙酰化4種核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4。此外，p300還是重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，參與調(diào)控基因的表達(dá)和介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，在多個組織器官的生長發(fā)育中都起到重要作用。目前，p300基因在山羊中的基因結(jié)構(gòu)信息與不同器官中的表達(dá)尚不清楚。因此，了解p300在山羊中的基因結(jié)構(gòu)和不同器官中的表達(dá)有重要的生物學(xué)意義。本次試驗主要材料為胎羊8種不同器官，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測p300基因在胎羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、睪丸、卵巢和小腸8種器官中的表達(dá)量，為探討p300在不同器官中的作用和調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

購買了安徽省淮南市臨淮農(nóng)牧有限公司的三月齡山羊，分別采集心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、睪丸、卵巢、小腸等器官。

1.2 采集胎羊器官樣品

采樣前務(wù)必將所用的器械進行消毒處理，并準(zhǔn)備好采樣過程所用到的材料試劑等。首先將器官分成適當(dāng)大小的樣品并在生理鹽水中清洗，待清洗干凈后用錫箔紙包裹住并做好標(biāo)記然后放入液氮中，最后放在-80 ℃冰箱保存。

1.3 研磨胎羊器官樣品

首先將研杵和藥匙分別放入添加適量液氮的研體中預(yù)冷，然后從-80 ℃冰箱取出保存的器官樣品并放入研缽研磨，在研磨過程中要不斷地加液氮，必須保證液氮剛好沒過樣品。最后，當(dāng)研磨好的樣品呈粉末狀時，將該樣品放入已提前預(yù)冷好的凍存管中，加1 mL RNA-solv Reagent吹打混勻，標(biāo)好器官樣品名稱和日期。

1.4 提取器官RNA和反轉(zhuǎn)錄

采用OMEGA試劑盒(R6934-01，美國)依次提取心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、睪丸、卵巢、小腸8種器官的RNA，試驗操作流程參考試劑盒說明書。然后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，最后用NanoDrop 2 000分光光度檢測8種器官RNA的濃度。將提取好的RNA樣品用TRANS公司(AE311-03，中國北京)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如下：Total RNA或mRNA 500 ng；Anchored Oligo(dT) 18 Primer 1.0 μL；2×TS Reaction Mix 10 μL；EasyScript?RT/Enzyme Mix 1.0 μL；gDNA Remover 1.0 μL； RNase-free Water to 6.5 μL。將上述反應(yīng)體系混勻后放在4 ℃ 13 523g(轉(zhuǎn)子型號：FA-45-24-11，5424/5424R)離心3 min，再置于PCR儀中42 ℃孵育30 min，95 ℃加熱3 min，4 ℃ 終止反應(yīng)，將cDNA放在-20 ℃保存。

1.5 p300基因引物設(shè)計與驗證

通過NCBI官網(wǎng)查找山羊p300基因CDS序列并設(shè)計出3對引物，引物序列信息如下：

p300-1-F：5′-GTTACGGCAGGCACTAATG-3′，p300- 1-R：5′-GTGTCTAACTTCCTCTTGATGG-3′(引物p300-1擴增產(chǎn)物大小為165 bp)；p300-2-F：5′-GAGGAGGAGGAGCGGAAG-3′，p300-2-R：5′-CTG TGAGAGGTCGTTGGATAC-3′(引物p300-2擴增產(chǎn)物大小為180 bp)；p300-3-F：5′-AACAAGCCTTA CAGAACCTC-3′，p300-3-R：5′-ATGAACGCAGCCA ATAGC-3′(引物p300-3擴增產(chǎn)物大小為112 bp)。

首先從上海生工訂購設(shè)計好的3條引物，然后按說明書進行引物稀釋，接著配制下述的PCR反應(yīng)體系。PCR擴增條件為：94 ℃ 預(yù)變性30 min；98 ℃ 變性10 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30～35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 終止反應(yīng)。

接著，配制3% 瓊脂糖和PCR反應(yīng)體系：2×PremixTaq7.5 μL，Primer 1 0.5 μL，Primer 2 0.5 μL，Template cDNA 1.5 μL，滅菌水5 μL。再依次點樣、電泳跑膠，用全自動凝膠成像儀進行成像，并分析產(chǎn)物大小是否符合要求。

1.6 熒光定量PCR

采用定量試劑盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，Vazyme，中國南京)，配置如下反應(yīng)體系：2×SYBR GREEN 7.5 μL，Dye 1 0.3 μL，cDNA 1.5 μL，Primer 1 μL，RNase-free water 4.7 μL。一般3個復(fù)孔作為技術(shù)重復(fù)，根據(jù)需求適當(dāng)擴大體系，混勻后加到八連管中，蓋上管蓋，置于定量PCR儀器中，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，后兩步循環(huán)數(shù)為40。

1.7 山羊p300基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI官網(wǎng)查找山羊p300基因的生物信息，包含外顯子個數(shù)、染色體定位、跨越長度、mRNA長度、CDS長度、編碼氨基酸個數(shù)和p300基因的結(jié)構(gòu)，從而得到山羊p300基因序列的分析結(jié)果。接著，通過NCBI官網(wǎng)查找多個物種p300基因CDS和AA序列，利用DNAMAN軟件比較p300基因在多個物種間的同源性。最后，利用軟件MEGA分別添加多個物種的CDS和AA序列，分析得到p300基因在各物種中的進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊p300基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 山羊p300基因結(jié)構(gòu)

通過對山羊p300基因結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)其包含31個外顯子，定位在5號染色體，跨越長度63 766 bp，mRNA總長9 571 bp，CDS全長7 235 bp，編碼2 411個氨基酸(圖1)。

圖1 山羊p300基因結(jié)構(gòu)

2.1.2 比較p300在山羊和各物種同源性

利用DNAMAN比對山羊和綿羊、牛、豬、馬、黑猩猩、人、小鼠、大鼠p300基因序列，結(jié)果在核苷酸水平上，同源性依次為99.3%、97.97%、92.34%、91.65%、90.08%、89.22%、87.37、86.56%；在氨基酸水平上，同源性依次為99.54%、98.84%、96.2%、95.93%、94.63%、93.64%、92.98%、91.66%。p300基因在山羊和綿羊、牛、豬、馬、黑猩猩、人、小鼠、大鼠保守性都較高，其中山羊和綿羊的保守性最高。

2.1.3p300在不同物種間的進化關(guān)系

分別從核苷酸水平和氨基酸水平比較p300在不同物種間的進化關(guān)系，結(jié)果顯示：在核苷酸水平上，綿羊和山羊的進化關(guān)系最近，說明二者的親緣關(guān)系比較近，其次和豬、牛、馬的進化關(guān)系比較相近。而在氨基酸水平，山羊和綿羊的進化關(guān)系最近，說明二者的親緣關(guān)系比較近，其次和豬、牛的進化關(guān)系比較相近(圖2、圖3)。

圖2 p300在不同物種間的進化關(guān)系(CDS)

圖3 p300在不同物種間的進化關(guān)系(AA)

2.2 RNA完整性和濃度測定結(jié)果

將8種不同器官的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳、成像，結(jié)果顯示，8種不同器官均清晰地出現(xiàn)28S和18S這兩個條帶，說明8種不同器官的RNA完整性均較好，均未出現(xiàn)降解現(xiàn)象，可以進行后續(xù)實驗(圖4)。

圖4 各器官RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

同時檢測了心、肝、脾、肺、腎、睪丸、卵巢和小腸8種不同器官RNA的濃度、D260/D280和D260/D230，結(jié)果如表1所示。

表1 8種器官RNA濃度

2.3 引物驗證結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。

如圖6所示，分別是針對山羊基因p300設(shè)計的3條引物的實時熒光定量PCR熔解曲線，3條熔解曲線均為單峰，無多峰出現(xiàn)。

Marker—DNA分子標(biāo)記；1—p300-1 PCR產(chǎn)物；2—p300-2 PCR產(chǎn)物；3—p300-3 PCR產(chǎn)物。圖5 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖6 實時熒光定量PCR熔解曲線

結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳圖和熒光定量PCR的實驗結(jié)果可知，針對p300基因設(shè)計的第一條引物產(chǎn)物大小符合預(yù)期數(shù)值，且熔解曲線是單峰，說明引物特異性較好。因此，在后續(xù)的實驗中我們選用第一個引物。

2.4 p300在胎羊主要器官中的表達(dá)譜

利用SPSS Statistics 17.0、Microsoft Excel分析定量結(jié)果并制作出p300在胎羊8種主要器官中表達(dá)譜。由實驗結(jié)果(圖7)可知，山羊p300基因在心、肝、脾、肺、腎、睪丸、卵巢和小腸中均表達(dá)，其中山羊p300基因表達(dá)量最高的是心臟，其次是小腸，接著是腎、卵巢和睪丸，最后是肝、肺和脾。

不同數(shù)據(jù)上沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 p300在胎羊8種主要器官中的表達(dá)量

3 討論

本試驗結(jié)果表明，山羊p300基因定位于5號染色體，包含31個外顯子，跨越長度63 766 bp，mRNA總長9 571 bp，CDS全長7 235 bp，編碼2 411個氨基酸。此外，p300在物種間保守性較高，其中山羊與綿羊同源性最高。通過比對山羊、綿羊和豬等8個物種p300基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因所含外顯子、mRNA、CDS等并不完全一致。但是，比對山羊和綿羊這兩個物種的CDS和AA序列發(fā)現(xiàn)，p300基因的同源性和保守性均最高，說明物種之間的親緣關(guān)系最近，這可能由于山羊和綿羊的進化速度和程度比較一致，生物相似程度比較高。

本試驗結(jié)果表明，p300在山羊8種主要器官中均有表達(dá)，且表達(dá)存在差異性，其中心臟的表達(dá)量最高。以往研究表明，p300在雄性大鼠的心肌、肝臟、肺臟、腎臟、睪丸等器官中均有表達(dá)，其表達(dá)也具有差異性。可見，p300基因在山羊和雄性大鼠主要器官中的表達(dá)比較相似[8]。又有研究表明，p300一個等位基因的缺失會引起胚胎或新生兒的死亡[9]，表明p300對于胚胎發(fā)育以及新生兒的生長發(fā)育有著至關(guān)重要的作用，因此，研究p300基因?qū)τ趧游锷L發(fā)育有重要意義。目前，大多科學(xué)研究的動物模型是大鼠或小鼠，對其生長發(fā)育的研究也比較多、比較全面。因此，可以借鑒p300對大鼠生長發(fā)育的研究，進而研究p300對山羊生長發(fā)育的影響。本試驗發(fā)現(xiàn)，p300在山羊心臟中的表達(dá)量較高。而已有的研究表明，p300是心臟發(fā)育的一個重要組成部分，會參與心臟的形成、轉(zhuǎn)錄和發(fā)育[10]，且發(fā)生在小鼠心臟發(fā)育早期，這表明p300可能在胚胎心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用。有研究表明，p300會介導(dǎo)組蛋白H3K9乙酰化，從而參與調(diào)控GATA4在小鼠胚胎心臟發(fā)育中的時序表達(dá)[10-11]；p300是病理性左室肥大向心力衰竭的關(guān)鍵，會在心肌肥厚和心力衰竭中發(fā)揮重要作用[11]；特別是p300特異性抑制劑會緩解高血壓引起的左心室肥厚、心肌纖維化和舒張功能障礙[12]。p300還可能在心臟調(diào)節(jié)室間隔缺損中發(fā)揮重要作用[13]，同時還會與心臟相關(guān)的基因相互作用，從而影響心臟發(fā)育和調(diào)控一些心臟疾病[14-15]。比如：Bnip3通過促進p300乙酰轉(zhuǎn)移酶活性和選擇轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控心臟基因表達(dá)，可能還會影響心肌細(xì)胞形態(tài)[16]。因此，可以在本試驗的基礎(chǔ)上進一步深入研究p300是如何影響和調(diào)控心臟的生長發(fā)育，為促進動物健康生長發(fā)育提供一個新方向。此外，還有研究表明ICAM-1的上調(diào)常與肺炎癥和肺部疾病有關(guān)，而凝血酶會通過激活p300從而誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞中ICAM-1的表達(dá)[17]，這為解決肺部疾病提供了新的解決思路和方法。p300基因多態(tài)性還與糖尿病、腎病的發(fā)生密切相關(guān)，參與促進Ⅱ型糖尿病患者的蛋白尿[18]，這為糖尿病的治療也提供新的研究思路。雖然，本試驗結(jié)果顯示，p300在腎組織中的表達(dá)量不是很高，但相關(guān)研究表明，p300對于腎正常的生長發(fā)育至關(guān)重要。因此，可以在本試驗的基礎(chǔ)上進一步深入研究p300是如何影響和調(diào)控腎的生長發(fā)育，為促進動物健康生長發(fā)育提供一個新方向。

綜上所述，p300在胎羊的心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、睪丸、卵巢、小腸等8種主要器官中均有表達(dá)，且表達(dá)具有差異性。其中，p300在胎羊心臟中表達(dá)最高，而p300與心臟生長發(fā)育密切相關(guān)，后續(xù)可以從p300調(diào)控心臟生長發(fā)育方面進行深入研究，揭示p300調(diào)控心臟生長發(fā)育的機制，為保證山羊正常生長發(fā)育提供重要的理論依據(jù)。