香煙煙霧所致肺動脈高壓大鼠模型的肺小血管肌化程度及意義

孫得勝，劉虹延，劉先勝，歐陽瑤，徐永健

肺動脈高壓是臨床上比較常見、但是未受到重視的一類肺血管疾病，其特征是各種原因導致肺血管阻力異常增加，進而發生持續和顯著的肺動脈壓力升高、右心室功能障礙，最終導致失代償性心力衰竭，甚至死亡［1-2］。作為一種常危及生命的疾病，肺動脈高壓可以作為一類獨立的疾病，也可以作為多種常見疾病〔如慢性阻塞性肺疾?。ê喎Q慢阻肺）、慢性血栓栓塞、結締組織疾病等〕發生、發展的關鍵病理環節，以及增加上述疾病發病率和降低患者生存率的獨立危險因素，嚴重影響患者的生存質量及預后。近年來，雖然在肺動脈高壓基因和分子生物學方面的研究取得較大進展，但目前高發病率、高死亡率的現狀并無明顯改善。因此，積極探索其病理機制，進一步尋找有效的干預靶點具有重要臨床意義。

一項慢阻肺合并肺動脈高壓的小鼠模型實驗顯示，模型組小鼠的肺血管重塑與其肺小血管的肌化有關，隨著肺小血管肌化程度加重，模型組小鼠肺血管重塑程度加重，其血流動力學指標也隨之改變［3］。

以往認為，慢阻肺患者或者長期吸煙患者發生肺動脈高壓是因為患者患病過程中發生了缺氧，因為慢性缺氧刺激而引起肺血管收縮、紅細胞增多進而導致血液黏稠、肺小動脈重構，從而引發肺動脈高壓，因此部分學者認為此情況下肺動脈高壓的發生是繼發或伴發于慢阻肺［4］。但是有研究發現，部分慢阻肺患者中的吸煙人群在疾病的早期、甚至在肺功能正常且未發生明顯缺氧表現時已發生肺小血管重塑，香煙煙霧可直接作用于肺血管系統，導致肺動脈高壓［5-7］，但是具體機制尚不清楚，在這種單純的香煙煙霧的作用下是否伴有肺小血管肌化尚待研究。

本實驗擬研究在單純香煙煙霧刺激的情況下，能否有效構建肺動脈高壓動物模型，從而為研究肺動脈高壓的發病機制構建平臺，同時觀察在肺動脈重塑的發生、發展的過程中，肺小血管肌化在其中扮演的角色，為進一步深入探討香煙煙霧在這一發病過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 2018年1—5月在華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心進行實驗。選取清潔級雄性SD大鼠16只，體質量200 g左右，購于湖北省實驗動物中心〔SCXK（鄂）2015-0018〕。香煙煙霧暴露動物染毒系統（本課題組自主研發，專利號ZL201820234399.3），Olympus光學顯微鏡（奧林巴斯有限公司），通用型免疫組化試劑盒（上?；蚩萍脊荆?，小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），香煙（紅金龍牌，煙氣煙堿量0.6 mg、焦油含量9 mg、煙氣一氧化碳量11 mg，湖北中煙工業有限責任公司）。

1.2 造模方法 采用隨機數字表法將大鼠分為對照組和模型組，各8只。模型組大鼠在自制煙霧染毒箱［8］內接受香煙煙霧暴露，2次/d，燃香煙12支/次，連續造模4個月，箱內氧濃度波動于18%～21%，造模時箱內一氧化碳濃度為900 mg/L。對照組不予香煙煙霧刺激。模型組右心室收縮壓和平均右心室壓高于對照組可判定造模成功。

1.3 血流動力學指標檢測 造模滿4個月時，觀察大鼠活動、飲食、毛發等一般狀況并檢測右心室收縮壓和平均右心室壓。兩組大鼠逐只稱重量后，以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，迅速進行氣管插管、連接小動物呼吸機輔助通氣，并調節合適的吸呼比、潮氣量等。參考國內外多個研究團隊的經驗［9-12］，予右心導管法檢測血流動力學，具體如下：切開大鼠的頸部皮膚，分離大鼠頸靜脈，結扎靜脈遠端，在靜脈的近心端剪一楔形口，隨之順勢將內置有導絲的測量管插入，并輕輕地向前推進，后經鎖骨下靜脈進入右心房，然后緩慢進入右心室，此時可見導管內有血液回流，立即退出導絲，將導管末端連接探測儀，觀察波形并調整導管方向，待波形典型并穩定后記錄，最后以PowerLab 軟件分析右心室收縮壓和平均右心室壓。

1.4 評估右心室肥厚程度 檢測血流動力學指標后，取大鼠的肺葉組織予以4%多聚甲醛固定。剪破大鼠的右心耳，將心室里的血液用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈。剝離右心室室壁，心臟分離為右心室、左心室+室間隔兩部分，將各組織在干凈濾紙上濾去多余的水分，然后分別稱量。計算右心室肥厚指數、右心室重量和體質量的比值（RV/BW）。

1.5 肺血管肌化程度 將固定好的大鼠肺組織用石蠟包埋并制作切片，采用免疫組織化學法檢測肺小血管中α-SMA的表達，以評估肺血管肌化程度。α-SMA陽性表達長度＜血管周長的25%，記作未肌化；陽性表達長度＞血管總周長的75%，記作完全肌化；介于兩者之間的記為部分肌化。測量、計算兩組大鼠肺小血管總的肌化水平并分類計算兩組大鼠肺小血管完全肌化、部分肌化以及未肌化比例，并比較兩組間的差異。

1.6 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件分析數據。計量資料以（x± s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠的一般情況 造模4個月后，對照組大鼠活動、飲食、毛發等一般狀況未見異常，而模型組大鼠明顯表現出倦怠狀態，常蜷縮于角落，不積極尋覓食物，毛發也變得比較枯黃。模型組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓高于對照組，體質量低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 兩組大鼠右心室肥厚程度比較 模型組右心室肥厚指數和RV/BW高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表 2）。

2.3 兩組大鼠肺小血管肌化比例比較 肺動脈高壓模型組大鼠的肺血管中α-SMA的表達水平強于對照組（見圖1）。對照組大鼠的肺小血管肌化比例低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組肺小血管中未肌化比例低于對照組，部分肌化和完全肌化比例高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

3 討論

吸煙早已成為當今社會中一個嚴重影響健康的問題。大量科學證據表明，吸煙可導致多部位惡性腫瘤、多種慢性疾病、生殖與發育異常，還與其他很多疾病及健康問題的發生密切相關［13-15］。對于吸煙對健康影響的研究，目前常通過建立整體動物煙霧染毒模型來完成，如何成功建立模擬人類吸煙的動物模型是關鍵環節。因此，建立一種將香煙煙霧給實驗對象染毒的裝置是非常必要的，本課題組自主研發了香煙煙霧暴露動物染毒系統（專利號：ZL201820234399.3），為本研究的順利開展創造了有利條件。在科學研究的過程中，研究某一種致病因素對某一疾病的影響，需要盡可能地排除或避免其他容易導致該病的常見危險因素的混淆和干擾。市面上常見的小動物熏煙箱一般無法監測箱內的氧氣濃度和煙霧濃度，而本課題組研制的動物染毒系統在設計上兼顧了上述因素，一方面通過設置和調節恒定的煙霧濃度保障了造模條件的穩定性，另一方面通過氧濃度的監測避免了環境缺氧對研究結果的干擾。

表1 兩組右心室壓力和體質量比較（±s）Table 1 Comparison of the mean right ventricular pressure and body weight of two groups of rats at the completion of modeling

表1 兩組右心室壓力和體質量比較（±s）Table 1 Comparison of the mean right ventricular pressure and body weight of two groups of rats at the completion of modeling

體質量（g）對照組 8 2 1±4 1 3±2 4 9 3.8±1 5.0模型組 8 4 2±8 2 3±5 4 0 1.3±4.9 t值 6.9 9 5.3 7 5.8 7 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1組別 只數 右心室收縮壓（m m H g）平均右心室壓（m m H g）

表2 兩組大鼠右心室肥厚程度比較（±s）Table 2 Comparison of right ventricular hypertrophy between two groups of rats

表2 兩組大鼠右心室肥厚程度比較（±s）Table 2 Comparison of right ventricular hypertrophy between two groups of rats

注：RV/BW=右心室質量和體質量的比值

組別 只數 右心室肥厚指數 RV/BW對照組 8 0.21±0.01 0.39±0.08模型組 8 0.34±0.03 0.64±0.10 t值 10.96 5.13 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖1 大鼠小血管肌化水平（免疫組化，×100倍）Figure 1 Level of muscularization of pulmonary arterioles in rats of control group versus those of the model group

表3 對照組和吸煙組大鼠小血管肌化水平的比較（±s，%）Table 3 Comparison of the level of muscularization of pulmonary arterioles between two groups of rats

表3 對照組和吸煙組大鼠小血管肌化水平的比較（±s，%）Table 3 Comparison of the level of muscularization of pulmonary arterioles between two groups of rats

完全肌化比例對照組 8 2 1.3 3±4.0 4 8 2.0 0±2.1 6 1 0.6 7±2.0 4 1 0.6 7±1.9 7模型組 8 4 1.3 3±1.5 3 5 4.0 0±3.0 4 1 7.0 0±2.2 5 2 5.6 7±3.3 8 t值 8.0 2 8.7 6 1.9 8 4.6 9 P值 ＜0.0 1 ＜0.0 1 ＜0.0 5 ＜0.0 1組別 只數 總肌化比例 未肌化比例 部分肌化比例

香煙煙霧能否作為獨立危險因素直接引起肺動脈高壓，仍存在爭議，甚至世界衛生組織的肺動脈高壓會議給出的肺動脈高壓分類說明也沒有確認吸煙是肺動脈高壓的致病因素［16］。但是，部分吸煙的肺動脈高壓患者并沒有伴發慢阻肺。而關于香煙煙霧引起的慢阻肺的研究發現，肺循環的改變發生在該疾病的初期，而缺氧在該疾病的早期并不存在，從而表明香煙煙霧刺激可能直接引起肺動脈高壓［5，17］。因而，探討單純的香煙煙霧的造模刺激是否能誘導出肺動脈高壓的疾病模型、并進一步探究其機制，具有重要的理論和現實意義。

本研究結果顯示，模型組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓高于對照組。眾所周知，右心室收縮壓和平均右心室壓在動物實驗研究中常用來代表受試動物的肺動脈收縮壓及平均肺動脈壓，所以上述結果提示本研究肺動脈高壓動物模型構建成功。

因為缺氧是引起肺動脈高壓的常見危險因素，本研究為了排除環境缺氧對實驗結果的干擾，實時監測了造模期間香煙煙霧暴露動物染毒系統中氧氣的濃度。另外，本課題組前期研究采集各組大鼠的腹主動脈動脈血1 ml行動脈血氣分析，各組間大鼠的動脈血氧分壓無差異（P＞0.05）［18］，從而確保本研究造模過程中肺動脈高壓的發生是在單純的香煙煙霧的刺激下形成的，進一步避免了缺氧因素在本研究中的混雜作用。

右心室肥厚指數和RV/BW是常用的檢測右心室肥厚程度的指標，本研究結果顯示，模型組右心室肥厚指數和RV/BW高于對照組，提示隨著患鼠肺動脈高壓的發生、發展，其右心室肥厚程度比對照組明顯加重，這也符合臨床上肺動脈高壓患者的右心室病理改變的特點。

本研究還發現，模型組大鼠的肺小血管中α-SMA的表達水平強于對照組，提示在香煙煙霧的長期刺激下，大鼠的肺小血管的肌化程度明顯加重，本研究結果與國外的一項關于慢阻肺合并肺動脈高壓的小鼠模型研究得到的結論一致［3］。對照組大鼠的肺小血管肌化比例低于模型組，模型組肺小血管中未肌化比例低于對照組，部分肌化和完全肌化比例高于對照組，結果顯示肺動脈高壓模型組的未肌化肺小血管明顯減少，而完全肌化了的肺小血管和部分肌化了的肺小血管的比例明顯升高。

肺小血管的肌化改變是肺血管重塑比較常見的表現形式，而肺血管重塑是肺動脈高壓發病環節中除了肺血管收縮以外最重要的病理特征之一，被認為是肺動脈高壓發生、發展的重要病理基礎［19］。本研究發現，在香煙煙霧刺激誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，單純香煙煙霧刺激可直接導致肺動脈高壓的發生，香煙煙霧可作為肺動脈高壓致病的獨立危險因素，進一步研究發現，肺動脈高壓患鼠的肺小血管的肌化程度，比健康對照組明顯加重，提示著其發病可能與肺小血管的肌化程度加重有關。

綜上所述，單純香煙煙霧刺激可直接誘發肺動脈高壓，其發病機制可能與肺小動脈都的肌化程度加重有關。

作者貢獻：孫得勝進行研究設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；劉虹延、劉先勝、歐陽瑤進行研究實施、評估、資料收集；孫得勝、徐永健進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。