早期2型糖尿病腎病患者血糖波動與氧化應激、炎癥及單核細胞自噬的相關性

周建華 李曉華 貝鵬劍 徐艷紅 李麗華 朱祎

(上海中醫藥大學附屬第七人民醫院內分泌科，上海 200137)

血糖波動參與糖尿病腎病的發生發展，但機制尚不完全明了。氧化應激和炎癥是糖尿病腎病發病的重要機制，而自噬在糖尿病腎病中的作用也受到越來越多的關注。血糖波動通過氧化應激引起糖尿病腎臟損傷，關于血糖波動與單核細胞自噬相關性的體內外研究均尚未見報道。本研究觀察糖尿病腎病早期患者血糖波動與氧化應激、炎癥因子及單核細胞自噬的相關性，旨在為糖尿病腎病的防治尋找新的靶點。

1 資料與方法

1.1資料 選取2016年11月至2018年11月上海中醫藥大學附屬第七人民醫院內分泌科就診的早期2型糖尿病腎病患者120例。入選標準：①符合1999年世界衛生組織(WHO)2型糖尿病診斷標準。②3 mg/g≤2次尿白蛋白肌酐比(UACR)平均值<30 mg/g。③糖化血紅蛋白(HbA1c)≤7%。④近3個月未改變降糖方案。⑤無低蛋白血癥及貧血。⑥排除糖尿病急性并發癥、嚴重大血管并發癥(如心梗、腦梗)及其他可能影響糖代謝(如肺感染、心力衰竭、腎衰竭等)的疾病。⑦排除其他類型的非糖尿病腎病。⑧排除合并高血壓患者。⑨排除近期使用影響糖代謝及抗氧化應激藥物的患者。根據平均血糖波動幅度(MAGE)分成兩組：A組：MAGE<3 mmol/L，B組：MAGE≥3 mmol/L。本研究經醫院倫理委員會與批準，患者及家屬知情并同意本研究。

1.2主要儀器與設備 貝克曼5800全自動生化分析儀：日本貝克曼公司，全自動酶免儀：西班牙Triturus，電泳儀：美國Bio-Rad公司，轉膜儀：美國Bio-Rad公司，成像儀：美國Bio-Rad公司。

1.3主要試劑 人單核細胞趨化蛋白(MCP)-1酶聯免疫吸附試驗測定試劑盒：購自上海博舜公司，人腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗測定試劑盒：購自上海博舜公司，人白細胞介素(IL)-6酶聯免疫吸附試驗測定試劑盒：購自上海博舜公司，尿游離8-異前列腺素(8-isoPG)F2α酶聯免疫吸附試驗測定試劑盒購自美國Cayman公司，Anti-LC3B抗體：購自英國Abcam公司。

1.4觀察指標 兩組患者均測量身高、體重、腰圍，計算體重指數(BMI)，予動態血糖監測(CGMS)72 h評估MAGE，外周血檢測總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹胰島素(FINS)、HbA1c、MCP-1、TNF-α、IL-6、單核細胞LC3B-Ⅱ水平，留取晨尿監測UACR，24 h尿檢測8-isoPGF2α。

1.5主要指標測定 血脂分析采用全自動生化分析儀，FINS測定采用電化學發光法，HbA1c測定采用離子交換高效液相色譜分析法，MCP-1、TNF-α、IL-6、8-isoPGF2α測定采用酶聯免疫吸附試驗，外周血單核細胞LC3B-Ⅱ水平測定采用Western印跡法。

1.6統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行正態性檢驗、方差齊性檢驗、t檢驗、秩和檢驗、χ2檢驗及多元線性逐步回歸分析。

2 結 果

2.1基本資料 兩組性別、HbA1c、FINS、年齡、TC、LDL-C、HDL-C、腰圍對比差異無統計學意義(P>0.05)；與A組相比，B組UACR、MAGE、TG、BMI、8-isoPGF2α、MCP-1、IL-6、TNF-α顯著更高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組基本資料比較

2.2多元線性逐步回歸分析UACR影響因素 以UACR為因變量，年齡、MAGE、FINS、TC、LDL-C、TG、HDL-C、BMI、腰圍、8-isoPGF2α、MCP-1、IL-6、TNF-α為自變量，僅MAGE、8-isoPGF2α、MCP-1進入最終方程，方程為：UACR=-6.336+7.824 MAGE+0.079 8-isoPGF2α+0.029 MCP-1，其中MAGE與UACR相關系數最大。

2.3兩組外周血單核細胞自噬水平比較 與A組相比，B組LC3B-Ⅱ水平及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明顯下降(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 兩組LC3B Western印跡結果

表2 兩組外周血單核自噬水平比較

3 討 論

糖尿病腎病是2型糖尿病常見的微血管并發癥，它的發生發展與血糖波動密切相關。研究發現〔1〕，在10項2型糖尿病患者的研究中，有9項報告顯示血糖變異性與糖尿病微血管并發癥發展或進展顯著正相關。體外研究結果顯示，與持續高葡萄糖處理組相比，間歇性高葡萄糖處理組通過上調骨橋蛋白的表達加劇大鼠系膜細胞增殖和膠原合成〔2〕。動物實驗研究發現，與持續高血糖組相比，血糖波動組糖尿病大鼠腎小球肥大，毛細血管基底膜增厚，腎小囊腔擴大，基質增加，腎小管體積、腎肥大指數、腎小球硬化指數和Ⅳ型膠原含量均呈上升趨勢〔3〕。MAGE目前被認為是評估日內血糖波動的金標準〔4〕。故本研究選用MAGE作為評價血糖波動的指標。本研究結果提示，血糖波動可能是血糖控制良好的早期2型糖尿病腎病患者的最重要影響因素。

氧化應激和炎癥〔5〕是糖尿病腎病發病的重要機制。大多研究證實，血糖波動通過氧化應激和炎癥引起糖尿病腎臟損傷。Chang等〔6〕研究表明血糖波動大的糖尿病患者處于高氧化應激及慢性炎癥狀態。體外研究發現，急性波動性高血糖加劇了內皮細胞的氧化應激及促炎癥因子的表達〔7〕。動物實驗研究發現，血糖波動增加了腎組織的氧化應激，抑制了蛋白激酶B(Akt)信號通路，加劇了腎組織超微結構的損害〔8〕。而增加的細胞內活性氧是炎癥的直接激活劑〔9〕。血糖波動的減少可以直接降低患者體內的氧化應激水平〔10〕，HbA1c水平的波動減少，可降低糖尿病腎病的發生率〔11〕。而抗氧化及抗炎治療治療也可以改善糖尿病腎臟損傷〔5，12，13〕。8-isoPGF2α為自由基介導的花生四烯酸氧化形成的產物，是反映氧化應激的可靠指標〔14〕。MCP-1作為重要的炎癥因子〔15〕，是已知最強的趨化因子，能夠促進巨噬細胞中單核細胞的轉化，并將巨噬細胞招募到炎癥部位，并通過產生炎癥細胞因子而導致局部和全身的炎癥，對糖尿病腎病的發展和進展具有重要意義。TNF-α由單核巨噬細胞產生，可以直接誘導炎癥發生，同時還可刺激炎癥細胞產生更多的炎癥介質，引起“瀑布式”炎癥級聯反應〔16〕。IL-6可由多種細胞產生，可延緩中性粒細胞的凋亡，使炎癥反應持續存在〔17〕。因此，本研究選用8-isoPGF2α作為氧化應激指標，MCP-1、TNF-α及IL-6作為炎癥指標。本研究結果顯示，相較于血糖波動小組，血糖波動大組UACR與8-isoPGF2α及MCP-1、IL-6、TNF-β明顯增高，UACR相關性分析顯示，MAGE、8-isoPGF2α及MCP-1是UACR獨立危險因素，即在早期2型糖尿病腎病患者中，血糖波動大組UACR水平及氧化應激水平、炎癥因子水平均較血糖波動小組更高，且MAGE、氧化應激及MCP-1與UACR獨立相關，與以往研究一致。同時，本研究還發現，相較于血糖波動小組，血糖波動大組TG及BMI更高，考慮可能與高BMI及高TG患者飲食管理相對較差、餐后血糖管理不佳致血糖波動較大有關，也可能與胰島功能差異有關〔18〕。前期研究發現〔18〕，初診2型糖尿病患者的晚相胰島素分泌水平與BMI呈負相關，而晚相胰島素分泌水平越低，血糖波動越大。然而，在相關性分析中，并未顯示BMI及TG與UACR相關，因此，BMI及TG與血糖波動的相關性可能還需要更大樣本量的臨床研究來進一步探討。

近年來，自噬在糖尿病腎病中作用受到越來越多的關注。LC3B-Ⅱ是公認的自噬標志物〔19〕。大多研究表明，自噬缺陷參與糖尿病腎病的發生發展〔20,21〕，激活自噬可能具有腎保護作用〔22,23〕。研究表明，單核巨噬細胞參與了糖尿病腎病早期的腎損傷〔24,25〕，它們通過產生炎癥細胞因子而導致局部和全身的炎癥〔16,17〕。Menne等〔26〕發現，MCP-1的抑制劑可降低糖尿病腎病患者的蛋白尿。本研究結果提示，與血糖波動小組比較，血糖波動大組外周血單核細胞LC3B-Ⅱ水平及LC3B-Ⅱ/LC3B-1比值均明顯下降，即自噬活性減弱，并與尿ACR、MAGE、8-isoPGF2α及MCP-1呈負相關。一般來說，當腎細胞暴露在包括缺氧、基因毒性損傷、氧化應激和內質網應激等應激條件下時，自噬被激活，并對細胞存活起到關鍵作用〔27〕。然而，當細胞內壓力仍未解決時，長時間自噬上調進入自噬缺陷〔28〕。在營養或能量過剩的狀態下，自噬被下調。盡管這種下調在短期內是有益的，但有缺陷的自噬可能最終導致細胞損傷的累積，從而導致代謝性或年齡相關性腎臟疾病的發展〔29〕。Fiorentino等〔30〕在一項小樣本的臨床研究中發現，糖尿病腎病患者活檢腎臟組織參與自噬的山羊組織金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)3、叉頭框轉錄因子O亞族(foxo)1和foxo1靶基因顯著減少，而foxo1轉錄抑制因子信號轉導及轉錄激活因子(STAT)1表達顯著增加，即腎組織自噬活性在一定程度上下降。動物實驗研究中也發現〔31〕，高血糖狀態下，足細胞的自噬活性隨著自噬相關蛋白表達水平的降低而降低。急性高葡萄糖暴露可能通過活性氧激活自噬。在體外實驗中發現，在暴露于高葡萄糖下的條件性永生化鼠足細胞(CIMPs)中，自噬在24 h內被誘導，同時產生活性氧，而抗氧化劑可抑制自噬〔32〕。活性氧介導的自噬作用在用飽和脂肪酸棕櫚酸處理24 h的培養足細胞中得到進一步的觀察〔33〕。這些結果提示足細胞對早期糖尿病的活性氧有積極的自噬作用。然而，高葡萄糖對足細胞自噬的影響似乎是時間依賴性的。Lenoir等〔34〕發現，24 h后高葡萄糖促進原代足細胞自噬通量，重組人自體吞噬相關蛋白(Atg)5缺失使足細胞對高葡萄糖誘導的細胞凋亡敏感，在穩定的足細胞系SVI細胞中，48 h后高葡萄糖誘導自噬，15 d后自噬被抑制。Tagawa等〔35〕進一步證實足細胞自噬功能不全在晚期糖尿病腎病中起關鍵作用。近年來，越來越多的證據支持自噬在炎癥中的作用〔36,37〕。自噬缺陷能誘導核轉錄因子(NF)-κB介導的炎癥〔38〕。自噬可以調節單核細胞的炎癥反應。Alizadeh等〔39〕發現，在2型糖尿病患者中，雷帕霉素靶蛋白(mtor)信號通路的激活導致外周血單核細胞自噬減少，炎癥因子表達增加。氧化應激可能介導了自噬缺陷促進的炎癥發生。Liu等〔9〕發現，自噬阻滯導致受損的、產生活性氧的線粒體堆積，從而激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLRP)3炎癥小體。NLRP3的炎癥活性受自噬的負調節，而由非特征性細胞器產生的活性氧的正調節。基于以上血糖波動與氧化應激及炎癥相關性及自噬與氧化應激及炎癥的相關性，推測在早期的糖尿病腎病患者中，急性血糖波動引起氧化應激，激活單核細胞自噬，減少MCP-1釋放，起到一定的腎臟保護作用，而持續的血糖波動引起的持續的氧化應激，最終仍導致單核細胞的自噬缺陷，MCP-1分泌增加，加之血糖波動及氧化應激本身刺激的MCP-1分泌，腎臟炎性損傷加重，蛋白尿增加。但因本研究樣本量較小及臨床研究的局限性，具體的通路機制及研究結果仍需要進一步的動物實驗及體外實驗來揭示和證實。

綜上所述，在早期2型糖尿病腎病患者中，持續的血糖波動可能通過持續的氧化應激，導致外周血單核細胞的自噬缺陷，MCP-1分泌增加及血糖波動及氧化應激本身刺激的MCP-1分泌，參與糖尿病腎病的發生發展。因此，在糖尿病腎病的防治中，除了減少血糖波動、抗氧化治療及抗炎治療，適當的自噬激活可能是一個新的方向。然而，血糖波動導致自噬缺陷的具體機制還有待于進一步研究。