當(dāng)歸四逆湯有效成分最佳組合抑制氧化應(yīng)激干預(yù)心肌再灌注損傷

劉會會 賀少輝 劉美林 尹佳 強(qiáng)明敏 高宇勤

(1西安市第九醫(yī)院，陜西 西安 710054；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

缺血再灌注損傷是心肌缺血再灌注后出現(xiàn)的一種病理現(xiàn)象，與過度氧化應(yīng)激有關(guān)，過度的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致丙二醛(MDA)蓄積，而過多MDA可造成組織損傷、基因突變、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致心肌梗死面積增加〔1,2〕。超氧化物歧化酶(SOD)可減輕氧化應(yīng)激從而降低MDA，進(jìn)而減少心肌再灌注損傷引起的心肌梗死面積〔3,4〕。本課題組前期研究表明當(dāng)歸四逆湯主要成分芍藥苷、阿魏酸、肉桂酸、甘草酸等4種有效成分對心肌再灌注損傷有保護(hù)作用〔5〕，但這4種成分是否在心肌缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激中起干預(yù)作用，以及這4種藥物如何組合可發(fā)揮其最佳藥效，目前尚無研究。故本實驗?zāi)康闹饕接戇@4種成分對心肌缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激的干預(yù)作用及最佳藥物組合。目前正交實驗是針對多因素水平的重要研究方法，其優(yōu)點是“均勻分散，齊整可比”，可以用少量的樣本探究多因素水平的變化，是分析因式設(shè)計的主要方法，通過此種實驗設(shè)計可以找出多因素不同作用，節(jié)省樣本量。本實驗利用在體大鼠冠狀動脈前降支(LAD)結(jié)扎術(shù)模型，采用正交實驗設(shè)計方法，探討當(dāng)歸四逆湯有效成分通過干預(yù)氧化應(yīng)激減輕大鼠在體心肌缺血再灌注損傷，并力求找到最佳雞尾酒組合。為拓展當(dāng)歸四逆湯臨床應(yīng)用范圍提供初步的基礎(chǔ)試驗研究。

1 材料及方法

1.1試劑與儀器 芍藥苷、阿魏酸、甘草酸及肉桂酸購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(批號分別為ZL20090409SYG、ZL20090425AWS、ZL20090301GCS、ZL2008009RGS)，SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白含量測定試劑盒購于凱基生物有限公司。

1.2動物模型的建立 SPF 級雄性SD(128只)大鼠，體重280～400 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。許可證號：SCXK(粵)2008-0002，將大鼠稱重、麻醉、固定、備皮消毒、分離皮下組織及肌肉、顯露氣管、氣管插管，接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率60次/min、通氣量20 ml/kg。縱行剪開第三胸骨左緣胸部皮膚約4 cm，鈍性分離，顯露胸膜，撐開肋骨，撕破心包，顯露心臟，確定縫扎位置(肺動脈圓錐與左心耳交界處下方2 mm，前降支LAD近端位置)。疊1個0.8～1.0 mm的凹槽硅膠管，用0號線，出針打結(jié)結(jié) 扎LAD，缺血30 min，松開結(jié)扎,復(fù)灌2 h。模型復(fù)制 的可靠性以心電圖(ECG)Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高為心肌 缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功。本實驗 建模總共有12只SD大鼠因為麻醉和手術(shù)原因亡，死亡率為9.3%〔5〕。

1.3分組及給藥方案 實驗選用L16(44)正交實驗表，每味藥為1種因子，其代號隨機(jī)選定，分別編為A甘草酸、B阿魏酸、C芍藥苷、D肉桂酸4種因子，取不用藥、低劑量、中劑量、高劑量4種水平，分別設(shè)為1為不用藥，2為低劑量組，3為中劑量組，4為高劑量組4種水平，甘草酸：灌胃劑量分別為25 mg/kg(低劑量)、50 mg/kg(中劑量)、100 mg/kg(高劑量)；芍藥苷：灌胃劑量分別為25 mg/kg(低劑量)、50 mg/kg(中劑量)、100 mg/kg(高劑量)；肉桂酸：灌胃劑量分別為100 mg/kg(低劑量)、200 mg/kg(中劑量)、400 mg/kg(高劑量)；阿魏酸：灌胃劑量分別為200 mg/kg(低劑量)、300 mg/kg(中劑量)、400 mg/kg(高劑量)；以上劑量都是全天劑量，1次/d，灌胃4 d，最后一次于手術(shù)前30 min給予。見表1。

表1 正交實驗L16(44)設(shè)計表(n=8)

1.4檢測心肌中SOD、MDA

1.4.1檢測心肌SOD 實驗終點時暴露心臟，原位結(jié)扎左冠狀動脈主干，經(jīng)主動脈逆行灌注(壓力為80 mmHg)0.5% Evan藍(lán)2～3 ml，立即取心臟，以預(yù)冷生理鹽水沖洗殘余液，將左心室與其他心肌組織分離，快速置于液氮中，取出冷凍心臟，沿左心室長軸方向連續(xù)環(huán)切，每片2～3 mm，正常心肌組織為藍(lán)色，缺血區(qū)心肌組織為粉色，然后將無藍(lán)染缺血心肌置入1% TTC磷酸緩沖液(pH 7.4)中37℃孵育20 min，此時壞死區(qū)呈灰白色，非壞死區(qū)呈深紅色，其后將壞死區(qū)和非壞死區(qū)分離。然后取左心室廣泛灰白缺血區(qū)0.2 g，濾紙吸干，加裂解液溶解，取上清液離心，過濾除去試管中上層脂肪組織，保留上清液。樣品準(zhǔn)備完畢后用BCA蛋白濃度測定試劑盒計算出樣品中總SOD含量，最后根據(jù)SOD試劑盒計算出單位細(xì)胞內(nèi)SOD含量。

1.4.2檢測心肌MDA 取0.2 g左心室廣泛灰白區(qū)按照上述步驟制備成上清液。然后按照BCA蛋白含量測定試劑盒計算出樣品中總MDA含量。最后用MDA試劑盒計算出單位細(xì)胞內(nèi)MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1心肌 SOD 測定結(jié)果 本實驗通過對SOD活力的正交實驗直觀表(表2)分析，比較各因素的極差發(fā)現(xiàn)阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸對于大鼠心肌缺血再灌注損傷模型SOD活力影響的順序是甘草酸>阿魏酸>芍藥苷>肉桂酸，通過方差分析(正交設(shè)計16組進(jìn)行方差分析，以α<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義)發(fā)現(xiàn)甘草酸有統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。根據(jù)心肌組織SOD活力實驗數(shù)據(jù)越大越有利，方差分析發(fā)現(xiàn)甘草酸有統(tǒng)計學(xué)意義，故阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸四藥混合干預(yù)大鼠心肌缺血再灌注損傷的心肌組織SOD的活力最佳選擇方案是芍藥苷0 mg/kg、甘草酸50 mg/kg、阿魏酸0 mg/kg、肉桂酸0 mg/kg。

表2 四種藥物干預(yù)大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌SOD、MDA正交實驗L16(44)直觀分析

表3 正交實驗16組心肌SOD方差分析結(jié)果

2.2心肌MDA測定結(jié)果 本實驗通過對心肌MDA的正交實驗直觀表(表2)分析，比較各因素的極差發(fā)現(xiàn)阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸，大鼠心肌缺血再灌注損傷模型MDA影響的順序是肉桂酸>阿魏酸>芍藥苷>甘草酸，通過方差分析(正交設(shè)計 16 組進(jìn)行方差分析，以α<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義)發(fā)現(xiàn)阿魏酸及肉桂酸有統(tǒng)計學(xué)意義(見表4)。根據(jù)心肌組織MDA實驗數(shù)據(jù)越小越有利，方差分析發(fā)現(xiàn)阿魏酸及肉桂酸有統(tǒng)計學(xué)意義，故阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸四藥混合干預(yù)大鼠心肌缺血再灌注損傷的心肌組織MDA最佳選擇方案是芍藥苷0 mg/kg、甘草酸0 mg/kg、阿魏酸300 mg/kg、肉桂酸200 mg/kg。

表4 正交實驗16組心肌MDA方差分析結(jié)果

3 討 論

缺血再灌注損傷是缺血心肌恢復(fù)血流灌注過程中可誘導(dǎo)的損傷，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量氧自由基相關(guān)，而大量氧自由基可激活脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，不僅可以增加MDA含量還可損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞死亡〔6〕。SOD可清除氧自由基，從而降低MDA蓄積，進(jìn)而減少心肌再灌注損傷引起的心肌梗死面積。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷對氧化應(yīng)激引起的心肌再灌注損傷無明顯干預(yù)作用。而阿魏酸、肉桂酸、甘草酸等提取物可明顯升高SOD活性相應(yīng)降低氧化應(yīng)激及MDA含量，進(jìn)而減輕心肌再灌注損傷引起的心肌損傷且最佳雞尾酒組合為：阿魏酸300 mg/kg、肉桂酸 200 mg/kg、甘草酸50 mg/kg(縮寫為FCG)。此最佳組合可能是一種有效治療心肌缺血再灌注損傷的雞尾酒組合，為治療心肌再灌注損傷提供了新的理論依據(jù)。