分子印跡電化學發光傳感器檢測毒死蜱

張田欣 劉意明 楊敏麗

摘 ?要： 石墨相氮化碳納米薄片（g-C3N4NSs）具有優良的電化學發光（ECL）性能和良好的成膜特性.以g-C3N4NSs作為ECL材料，利用其良好的成膜性能將其固定在玻碳電極（GCE）上，再以毒死蜱（CPF）作模板分子，甲基丙烯酸（MAA）作功能單體，通過分子自組裝制備分子印跡聚合物（MIP）.將該聚合物引入g-C3N4NSs修飾電極，構建了一個MIP-ECL傳感器.除去模板分子的傳感器能夠選擇性識別CPF，利用CPF對g-C3N4NSs ECL信號的淬滅作用實現了CPF的高靈敏、高選擇性檢測.傳感器對CPF的線性響應范圍是1.0×10-8～1.0×10-4 mol·L-1，檢出限（LOD）是5.0 nmol·L-1，用于蔬菜中CPF殘留量檢測，結果令人滿意.

關鍵詞： 電化學發光（ECL）; 氮化碳納米薄片（g-C3N4NSs）; 分子印跡聚合物（MIP）; 毒死蜱（CPF）

中圖分類號： O 657.1 ? ?文獻標志碼： A ? ?文章編號： 1000-5137（2021）06-0697-09

Abstract： Graphite carbon nitride nanosheets （g-C3N4NSs） exhibite excellent electrochemiluminescence （ECL） performance and good film-forming properties. In this paper， g-C3N4NSs were used as an ECL material to be fixed on a glassy carbon electrode（GCE）. A molecularly imprinted polymer （MIP） was prepared by molecular self-assembly with chlorpyrifos （CPF） as template molecule and methacrylic acid （MAA） as functional monomer. The polymer was then introduced into g-C3N4NSs modified electrode to construct a MIP-ECL sensor. After removing the template molecule， the sensor can specifically recognize CPF. Based on the specific recognition and quenching effect of CPF on the ECL signal of g-C3N4NSs， the high sensitive and selective detection of CPF was achieved. The sensor shows a linear response to CPF in range of 1.0×10-8-1.0×10-4 mol·L-1 and limit of detection （LOD） of 5.0 nmol·L-1. It was used to detect CPF residues in vegetables and the results were satisfactory.

Key words： electrochemiluminescence（ECL）; carbon nitride nanosheets and the results were satisfactory（g-C3N4NSs）; molecular imprinting polymer（MIP）; chlorpyrifos（CPF）

0 ?引 言

毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）是一種有機磷農藥，分子式為C9H11ClNO3PS. CPF作為一種低毒性農藥，被廣泛用作農作物的殺蟲劑.CPF水溶性低、土壤吸附系數高，容易長時間殘留在自然環境中，造成城市水體污染和水生生物中毒[1-2].CPF還會通過胃腸道、皮膚、呼吸道等被人體吸收，引起神經缺陷、發育和自身免疫性疾病等[3]，因此準確、方便地檢測農作物和環境產品中的CPF殘留量，對人類健康和生態保護至關重要.

目前檢測CPF的方法包括氣相色譜法[4]、液相色譜-質譜聯用法[5]、化學發光法[6]、酶/抗體免疫分析法[7-8]、表面增強拉曼光譜法[9]、電化學發光（ECL）法[10]等.前幾種方法擁有優異的靈敏度與準確性，但也有很大的局限性，如儀器大且笨重、操作繁瑣復雜、價格昂貴、不適合現場實時檢測等.而ECL檢測靈敏度高、儀器設備簡單、背景信號低、檢測快速和方便，受到越來越廣泛的關注.

分子印跡技術（MIT）是針對目標分子構筑有效的印跡空腔，從而合成對目標分子具有特異性識別的分子印跡聚合物（MIP）[11]的技術.MIP因具有良好的機械/化學穩定性、高特異性、低成本，以及易于制備等特點，作為傳感器的識別單元，被廣泛應用于光學傳感器[12-13].

氮化碳納米薄片（g-C3N4NSs）是近幾年新發展的一種ECL材料，它不僅具有優良的ECL性能，而且毒性低、生物兼容性好，還具有良好的分散性和成膜特性. 迄今為止，還沒有將MIP與ECL相結合用于CPF檢測的報道.本工作以g-C3N4NSs作為ECL材料，結合MIP技術，構建了用于檢測CPF的MIP-ECL傳感器，實現了對CPF的高靈敏、高選擇性檢測.

1 ?實驗部分

1.1 實驗試劑

三聚氰胺（C3H6N6）、過硫酸鉀（K2S2O8）、乙酸（CH3COOH）、鹽酸（HCl）無水乙醇均購于Sigma-Aldrich公司;氫氧化鈉（NaOH）、氯化鉀（KCl）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）均購于國藥集團上海化學試劑有限公司;甲基丙烯酸（MAA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、毒死蜱（CPF）、偶氮二異丁腈（AIBN）均購于上海Adamas試劑公司;辛硫磷、馬拉硫磷、伏殺磷、阿維菌素、甲基對硫磷均購于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司.所有藥品均為分析純，溶液以超純水配置.

1.2 實驗儀器

透射電子顯微鏡（TEM），日本電子公司，JEOL 2100;場發射掃描電子顯微鏡（FE-SEM），日本日立公司，Hitachi S-4800;X射線光電子能譜（XPS），美國PE公司，ULVCA-PHI;紫外分光光度儀，日本島津公司，UV-1800;熒光分光光度儀，日本島津公司，RF-5301PC;恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械廠，GZX-DH-X;離心機，上海安亭科學儀器廠，TGL-16C;數控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司，KQ-100DE;恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器制造有限公司，95-I;pH計，上海洛奇特電子設備有限公司，PHS-25;馬弗爐，上海慧泰儀器制造有限公司，PRD-C3000;電化學工作站，上海辰華儀器有限公司，CHI 660E;ECL分析系統，西安瑞邁分子儀器責任有限公司，MPI-A/B.

三電極系統：工作電極為玻碳電極（GCE），鉑（Pt）絲為對電極，銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極（飽和KCl溶液）為參比電極.

1.3 g-C3N4NSs的合成

g-C3N4NSs的合成參照文獻[14]的方法，先合成體相g-C3N4，再經過酸化剝離而得到g-C3N4NSs.具體方法為：1） 稱7.5 g C3H6N6固體放入坩堝，馬弗爐600 ℃灼燒3 h，取出后自然降溫，得到淡黃色g-C3N4固體，研磨，備用;2） 取2.0 g合成好的g-C3N4固體粉末，加入100 mL濃HCl，攪拌6 h，用蒸餾水抽濾洗滌至pH=7.0，收集產物，烘箱60 ℃干燥4 h;3） 取50 mg產物，加50 mL超純水，超聲2 h，5 000 r·min-1離心6 min，去除未剝離的塊狀g-C3N4，取上層白色溶液，烘干即得g-C3N4NSs，使用時配置質量濃度為1.0 mg·mL-1的溶液.

1.4 MIP-ECL傳感器的構建

1.4.1 MIP制備

首先，量取5 mL甲醇于燒杯中，然后加入0.1 mmol的模板分子CPF和0.4 mmol的功能單體MAA，超聲5 min使其混勻，形成預聚合復合物.繼續加入0.4 mmol交聯劑EGDMA和0.016 g引發劑AIBN，自聚合反應30 min，得到MIP.同樣條件下，除了不加入CPF，其他操作步驟相同，獲得非分子印跡聚合物（NIP）.

1.4.2 傳感器構建

傳感器的構建如圖1所示.首先以0.5 μm的三氧化二鋁（Al2O3）打磨GCE至光滑，用蒸餾水和乙醇依次沖洗，再用超聲處理3 min，晾干.取6.0 μL g-C3N4NSs分散液滴涂在GCE上，晾干，即得g-C3N4NSs/GCE.再移取4 μL上述制備好的MIP聚合液滴涂在g-C3N4NSs/GCE上，得到MIP/g-C3N4NSs/GCE.把電極置于甲醇與乙酸體積比為9∶1的洗脫液里，靜置13 min，除去模板分子CPF，得到能特異識別CPF的分子印跡ECL傳感器，記為MIP-ECL傳感器.

1.5 ECL檢測

采用三電極系統，以修飾電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲電極為對電極，將該電極系統插入0.1 mol·L-1 PBS（pH=7.4，含0.1 mol·L-1 K2S2O8）溶液中，在0～-1.0 V的電壓范圍內以100 mV·s-1掃描速率，記錄ECL信號（光電倍增管電壓-600 V）.檢測CPF時，將上述制備的MIP-ECL傳感器插入不同濃度的CPF甲醇溶液，孵育14 min后取出，用蒸餾水沖洗干凈，插入檢測底液，根據孵育前后ECL信號的變化值（?I）對CPF進行定量檢測.

2 ?結果與討論

2.1 g-C3N4NSs的形貌表征

圖2（a）是剝離前體相氮化碳（C3N4）的FE-SEM圖，圖2（b）是剝離后g-C3N4NSs的TEM圖.可以看出，C3N4有很多層，并且呈大塊狀堆積，而g-C3N4NSs呈片狀，說明體相C3N4經過酸化處理后被成功剝離.

2.2 g-C3N4NSs的XPS表征

圖3是g-C3N4NSs的XPS圖譜.圖3（a）是g-C3N4NSs全譜圖，顯示了C，N，O元素的存在;圖3（b）是g-C3N4NSs中C 1 s的高分辨率譜圖，284.6，286.2和288.0 eV分別對應3種C的結合能;圖3（c）是g-C3N4NSs中N 1 s的高分辨率譜圖，4個峰398.5，399.8，401.0和404.1 eV分別對應4種N的結合能[15].通過以上參數，可以判斷g-C3N4NSs制備成功.

2.3 MIP-ECL傳感器的表征

測試了傳感器構建過程中相應電極的電化學阻抗（EIS），循環伏安（CV）和ECL信號、結果如圖4所示.

圖4（a）是不同修飾電極在5 mmol·L-1 [Fe（CN）6]3-/4-（含0.1 mol·L-1 KCl）溶液中的EIS響應曲線.可以看出，g-C3N4NSs/GCE（紅線2）的電阻值（Rct）明顯大于裸電極（黑線1），這是因為g-C3N4NSs是半導體，會妨礙[Fe（CN）6]3-/4-與電極表面電子轉移，導致Rct增加，證明了g-C3N4NSs成功地修飾到電極表面.當MIP模修飾到g-C3N4NSs/GCE時（藍線3），Rct急劇增加，因MIP膜不導電，會妨礙電子傳遞，導致Rct增大，說明MIP模成功引入.當模板分子CPF被洗掉，電子傳遞通道打開，電子傳遞速率明顯變快，Rct變小（綠線4）.重新孵育CPF后，Rct再次變大（粉線5），這是由于電子傳遞通道再次被阻塞.

圖4（b）是不同修飾電極在5 mmol·L-1 [Fe（CN）6]3-/4-（含0.1 mol·L-1 KCl）溶液中的CV響應曲線.該結果與EIS響應一致.

圖4（c）是不同修飾電極的ECL信號.g-C3N4NSs/GCE表現出很強的ECL信號，表明g-C3N4NSs被成功修飾到電極上.引入MIP后，ECL信號明顯降低;洗脫除去CPF后，ECL信號回升，重新孵育CPF后，空腔被堵住，ECL信號再次下降.

以上實驗結果均可證明MIP-ECL傳感器的成功構建.

2.4 實驗條件的優化

ECL信號會受到多種因素影響，包括pH值、電位掃描速率、模板分子洗脫時間和孵育時間，分別對此進行了考察，結果如圖5所示.

圖5（a）是pH值對ECL信號的影響.當pH值從6.0增加到7.4時，ECL信號逐漸增強;當pH=7.4達到峰值，pH值繼續增加時，ECL信號減小.這是因為pH值較小時，有較多質子被還原，影響了g-C3N4還原;但在堿性環境中，OH-和K2S2O8又還原生成的硫酸根陰離子自由基（SO4·-），會抑制氮化碳陰離子自由基（g-C3N4·-）轉化為激發態氮化碳（g-C3N4*）的過程，減少了激發態的g-C3N4*，導致ECL信號降低[16].因此，實驗中選擇pH=7.4.

圖5（b）是電位掃描速率對ECL信號的影響.掃速從80 mV·s-1增加到100 mV·s-1，ECL值逐漸增大，掃率超過100 mV·s-1后，ECL值反而減小.這是因為掃速高則需要更多的K2S2O8參與電極反應，但此時溶液中的K2S2O8來不及擴散到電極附近，所以ECL值減小.因此，選擇電位掃描速率為100 mV·s-1.

圖5（c）是不同洗脫時間的ECL信號.把MIP/g-C3N4NSs/GCE插入甲醇和乙酸混合溶液（體積比為9∶1）中進行洗脫，記錄不同洗脫時間對應的ECL信號.可以看出，當洗脫時間從6 min增加到13 min時，ECL值不斷變大，13 min后ECL信號幾乎沒有變化，說明MIP膜中的CPF已達到平衡狀態，ECL信號已達到最大值.因此，選擇模板分子CPF的洗脫時間為13 min.

圖5（d）是對CPF重新孵育時間的優化.把除去模板分子CPF的電極重新插入含CPF（1.0×10-5 mol·L-1）的溶液中進行孵育，記錄不同孵育時間對應的ECL信號.孵育時間4～14 min，ECL信號隨時間增加不斷減小，在14 min時降到最低，之后保持不變.因此，選擇14 min作為最佳孵育時間.

2.5 傳感器對CPF的ECL響應

在以上優化的條件下，檢測傳感器對不同物質的量濃度CPF的ECL響應信號，如圖6所示.圖6（a）是傳感器對不同物質的量濃度CPF的ECL響應信號.隨CPF濃度不斷增加，ECL強度不斷減小.圖6（b）是ECL強度的變化值（?I）與CPF物質的量濃度對數值（log C）之間的關系圖，?I與lg C在1.0×10-8～1.0×10-4 mol·L-1范圍內呈現良好的線性關系.線性回歸方程為?I（I0-I）=1 464.55 lg C-518.66（R2=0.997 9），I0是無CPF溶液的ECL值，I是不同物質的量濃度CPF溶液的ECL值，C為CPF的物質的量濃度（nmol·L-1）.LOD為5.0 nmol·L-1（信噪比S/N=3）.與其他檢測CPF的方法相比較，本方法具有較低的LOD和較寬的線性范圍，如表1所示.

2.6 傳感器的選擇性、穩定性、重現性的考察

為了檢測傳感器對CPF的選擇性識別能力，選取了其他幾種常見的農藥，包括辛硫磷、馬拉硫磷、伏殺磷、阿維菌素和甲基對硫磷（物質的量濃度均為1.0×10-3 mol·L-1），考察傳感器對它們的響應情況，結果顯示傳感器只對CPF（1.0×10-5 mol·L-1）產生響應，而對其他幾種農藥幾乎沒有響應，如圖7（a）所示.由此證明傳感器對CPF具有良好的選擇性識別能力，這主要歸功于傳感器表面引入的MIP膜，為了進一步證明這一點，按照同樣的條件制備了非分子印跡膜傳感器——NIP-ECL傳感器，并測試了它對目標分子CPF及以上非目標分子的ECL響應，結果顯示NIP-ECL對所有分子都沒有響應，說明NIP-ECL沒有特異性識別能力，這一結果進一步證明了MIP對目標分子的特異性識別能力.

把傳感器存于4 ℃環境中，每7 d測試一次ECL信號，連續測試28 d的ECL變化情況，如圖7（b）所示，最后一次測試響應信號強度依然能達到初始值的96%.對同一個傳感器連續進行10圈掃描，如圖7（c）所示，ECL信號幾乎沒有變化.同樣條件下，平行制備6個傳感器，測其ECL，6個傳感器的ECL信號的相對標準偏差（RSD）為2.4%，如圖7（d）所示.這些結果證明制備的傳感器具有良好的穩定性和重現性.同時，測試了傳感器的再生能力，結果顯示一個傳感器可反復進行3次連續的洗脫和孵育，信號基本穩定.

2.7 實際樣品中CPF的測定及回收實驗

以生菜和芹菜作檢測樣品來評估所構建的MIP-ECL傳感器的實際應用價值.樣品預處理步驟：分別取生菜樣品和芹菜品樣品各10 g（購自上海沃爾瑪超市），剪碎浸泡在25 mL的甲醇溶液中1 h，過濾后取上清液進行檢測.采用標準加入法，測試結果如表2所示.回收率為96.0%～100.9%，RSD不超過3.1%.結果表明：所構建的傳感器可用于實際樣品中CPF的檢測，具有實際應用價值.

3 ?結 論

以高效、低毒的g-C3N4NSs作為ECL材料，CPF作為目標分子，將高靈敏的ECL檢測技術與高選擇性的MIP技術相結合，成功構建了一個對CPF具有特異識別的MIP-ECL傳感器.傳感器對CPF的線性響應范圍為1.0×10-8～1.0×10-4 mol·L-1，檢出限（LOD）為5.0 nmol·L-1.該傳感器不僅靈敏度高、選擇性好，而且制作簡單、成本低，擁有優異的穩定性和重現性，可用于蔬菜中CPF含量檢測，結果令人滿意.

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（責任編輯：郁慧，顧浩然）