中速、變速和高速離心方法對制備洗滌紅細(xì)胞質(zhì)量的效果對比

黃春柳

惠州市中心血站(廣東 惠州 516003)

洗滌紅細(xì)胞是外科常用的成分輸血制品，制備方式是通過離心處理，將健康全血中90%的白細(xì)胞、血小板及血漿去除獲得[1]。隨著近年來血液制備技術(shù)的發(fā)展，洗滌紅細(xì)胞的制備更加便捷，臨床應(yīng)用也愈加廣泛，備受認(rèn)可。在洗滌紅細(xì)胞制備過程中，離心速度是影響洗滌紅細(xì)胞制品質(zhì)量的重要因素[2]，本文就中速、變速、高速三種離心條件下制備洗滌紅細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行對比分析，旨在為洗滌紅細(xì)胞制備提供客觀、有效、科學(xué)的指導(dǎo)依據(jù)。

1 一般資料及方法

1.1制備材料與設(shè)備選擇 選取惠州市中心血站2018年2月至11月無償獻(xiàn)血過程收集外觀無異常、血袋完整、ALT>40U/L、2～6℃下保存3～4d的123袋懸浮紅細(xì)胞；進(jìn)行不同離心速度下的洗滌紅細(xì)胞制備試驗(yàn)，試驗(yàn)過程用生理鹽水500mL及生理鹽水洗滌聯(lián)袋均購自上海輸血技術(shù)有限公司；選用北京瑞爾達(dá)生產(chǎn)的血漿游離血紅蛋白試劑盒及南京便診生物科技有限公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基；采用德國費(fèi)森尤斯生產(chǎn)的902880型號無菌接合機(jī)，日本SysmexKx-21的血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)的752型可見分光光度計(jì)及CentronTechnologies公司生產(chǎn)的SE330高效熱合機(jī)，所有材料、設(shè)備均按照操作說明書進(jìn)行使用。

1.2制備方法 按照試驗(yàn)要求將123袋懸浮紅細(xì)胞采用隨機(jī)方法分成三組，每組41袋。分別采取中速、高速、變速離心方法，進(jìn)行洗滌紅細(xì)胞制備。根據(jù)離心速度分組，中速組第1次離心速度控制在3500r/min，在4 ℃溫度條件下持續(xù)12min。第2次離心時間和第3次離心時間相同，均為10min，離心溫度條件與第1次相同。變速組第1次離心速度控制在3000r/min，在4℃溫度條件下持續(xù)離心12min。第2次與第3次離心操作速度調(diào)整為3800r/min，持續(xù)時間10min，溫度保持在4℃。高速組三次離心速度均設(shè)置為4000r/min，溫度保持在4℃，第1次離心10min，第2次、3次離心6min。將1袋生理鹽水(500mL)與懸浮紅細(xì)胞分別使用無菌接合機(jī)與洗滌聯(lián)袋接合，完成150mL生理鹽水灌入后混合均勻后離心1次，將白膜與上清液分離出去，重復(fù)操作共完成3次離心。將最后離心后的溶液中加入生理鹽水，將其配置為70%體積比的紅細(xì)胞懸液。

1.3檢測指標(biāo) 完成洗滌紅細(xì)胞懸液制備后，根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程(2015版本)》[3]采樣，并對每個樣本進(jìn)行紅細(xì)胞、白細(xì)胞、上清蛋白質(zhì)、血紅蛋白含量檢測，計(jì)算紅細(xì)胞回收率、白細(xì)胞清除率、溶血率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，三組計(jì)量資料比較，采用F檢驗(yàn)，若P<0.05，說明三組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三組血紅蛋白含量、上清蛋白含量結(jié)果比較三組血紅蛋白含量比較，中速組高于變速組和高速組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；三組上清蛋白含量對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 三組血紅蛋白含量、上清蛋白含量結(jié)果比較 mg/L

2.2三組紅細(xì)胞回收率、溶血率結(jié)果比較 對比分析三組紅細(xì)胞回收率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三組溶血率對比，中速組低于變速組和高速組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 三組紅細(xì)胞回收率、溶血率結(jié)果比較 %

2.3三組白細(xì)胞清除率、血漿蛋白清除率比較 對比分析三組血漿蛋白清除率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三組白細(xì)胞清除率對比，中速組明顯高于變速組、高速組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 三組血漿蛋白清除率、白細(xì)胞清除率結(jié)果比較

3 討論

洗滌紅細(xì)胞制備主要的目標(biāo)是利用離心方法實(shí)現(xiàn)血液成分分離，去除超過99%的血漿蛋白，去除超過80%的白細(xì)胞，并保留70%以上紅細(xì)胞情況下制成血液制品，用于臨床醫(yī)療中[4]。全血中因粒細(xì)胞與年輕紅細(xì)胞存在的比重相對接近，分離困難，在制備合格的洗滌紅細(xì)胞時，如何提升洗滌紅細(xì)胞質(zhì)量成為關(guān)鍵[5]。而隨著醫(yī)療設(shè)備、技術(shù)水平的不斷提升，醫(yī)療事件中對洗滌紅細(xì)胞懸液的質(zhì)量要求也逐漸升高，從原來只針對紅細(xì)胞回收率、血漿蛋白及白細(xì)胞清除率的要求，逐漸轉(zhuǎn)變到對血液制品本身的要求。在2015年的相關(guān)文件標(biāo)準(zhǔn)中[3]，對標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)用性考慮更多，但同時也考慮到血液制品制備過程的嚴(yán)格要求，可以從分離條件入手，考慮不同的離心速度下對洗滌紅細(xì)胞制備質(zhì)量的影響，在制備中尋找最佳方案，在保障洗滌紅細(xì)胞符合制備標(biāo)準(zhǔn)的前提下，實(shí)現(xiàn)洗滌紅細(xì)胞質(zhì)量的提升。

相關(guān)研究表明[6]，在相同離心條件下完成的洗滌紅細(xì)胞懸液制備品，其白細(xì)胞清除率與紅細(xì)胞回收率具有較大的變異范圍，可能是因?yàn)檠诜譂{夾中傾斜角度、離心過程血袋下陷程度、擠壓白膜操作手法熟練程度及測定中細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差存在關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行3次離心分離的目的就是為了保證去除效果[7]。選擇在4 ℃溫度條件下的紅細(xì)胞保存相對完整的全血進(jìn)行操作，根據(jù)離心條件進(jìn)行3次離心，對比不同速度下的離心效果。從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在保證洗滌紅細(xì)胞符合制備標(biāo)準(zhǔn)的前提下，中速離心組中血紅蛋白含量明顯高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中速組的白細(xì)胞清除率也明顯比另外兩組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中速組溶血率明顯低于變速組和高速組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。主要是因?yàn)槿心贻p紅細(xì)胞與粒細(xì)胞的比重接近，分離十分困難。此時可選擇粒細(xì)胞還沒沉積的全血進(jìn)行離心處理，利用中速離心條件能提升白膜層聚集性，從而促進(jìn)白膜層增厚，可見度更高，便于分離白膜。利用高速離心雖然也能起到這一離心效果，但高速離心容易造成白細(xì)胞片狀黏附，附著在血袋壁上難以分離干凈，導(dǎo)致白細(xì)胞去除效果不理想。變速離心組因第2次離心時降低了對紅細(xì)胞的損傷，降低溶血率。但因第1次離心過程白膜剩余少量白細(xì)胞，離心過輕無法很好的分離。要保證白細(xì)胞清除效果，必須擠出過量的紅細(xì)胞，將會損失白細(xì)胞回收率。中速離心則有助于保障粒細(xì)胞可以懸浮在白膜下，易于分離，因此選擇中速離心效果更好[8-9]。

為確保洗滌紅細(xì)胞懸液制備效果，還可以考慮以下兩方面：①選擇適宜的紅細(xì)胞壓積懸浮紅細(xì)胞，并在粒細(xì)胞尚未沉積時選擇中速離心方法，重復(fù)3次洗滌，可有效留取洗滌后的上清液。此時采用接駁空袋方式留樣，能保證制品的質(zhì)量。②在擠壓白膜的手法方面，必須重視首次白膜的去除。主要是因全血中的白細(xì)胞含量很高，在完成離心后白細(xì)胞會聚集一起，可清晰顯示白膜層，便于白膜清除。積壓過程可需將血袋傾斜30°置于漿夾板上，保證血袋比分漿夾板高，并緩慢擠出，將能減少去除白膜層過程中紅細(xì)胞的損失，從而達(dá)到紅細(xì)胞的回收率要求前提下，保證白細(xì)胞、血漿蛋白的清除效果。

綜上所述，在制備洗滌紅細(xì)胞懸液過程，采用中速離心方法效果突出，紅細(xì)胞回收率、白細(xì)胞去除率、溶血率明顯優(yōu)于變速離心、高速離心，是手工洗滌中較好的離心方式，在符合洗滌紅細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)要求的前提下，采取中速離心方法得到的洗滌紅細(xì)胞質(zhì)量最優(yōu)。