采用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)常見(jiàn)乳源成分

劉鳴暢,王洪越,方舒正,李唯熙,楊艷歌,吳亞君

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100176；2.河北工程大學(xué)，河北邯鄲056038）

0 引言

2018年《國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于推進(jìn)奶業(yè)振興保障乳品質(zhì)量安全的意見(jiàn)》[1]中提出，積極發(fā)展乳肉兼用牛、奶水牛、奶山羊等其他奶畜生產(chǎn)，進(jìn)一步豐富乳源結(jié)構(gòu)。并且，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等九部委聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于進(jìn)一步促進(jìn)奶業(yè)振興的若干意見(jiàn)》[2]明確指出要重視開(kāi)發(fā)羊乳、水牛乳等特色乳制品。驢乳、馬乳、駱駝乳、水牛乳、牦牛乳、羊乳等作為市場(chǎng)上的主要特色乳品，近年來(lái)得到了良好的發(fā)展，產(chǎn)量均呈上升趨勢(shì)[3-5]。

相關(guān)研究表明，特色乳因其蛋白結(jié)構(gòu)與牛乳蛋白存在差異，所以致敏性較低[6-7]，特別是對(duì)于體弱的嬰幼兒和老年人。Caballos等[8]研究表明與牛乳蛋白相比，山羊奶蛋白更易消化且致敏性較低；Egito等[9]研究認(rèn)為馬乳可以大大緩解消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病癥狀；駱駝乳對(duì)于Ⅰ型糖尿病患者的微量白蛋白尿癥狀有明顯的輔助治療作用；此外，驢乳乳清蛋白含量較高，更接近于母乳乳清蛋白含量，是作為一段嬰幼兒配方乳粉的優(yōu)質(zhì)原料[10-12]。但由于驢、馬、羊、駱駝等動(dòng)物產(chǎn)奶率較低，所以特色乳品的售價(jià)較高，在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，以牛乳摻假的現(xiàn)象較為常見(jiàn)。為保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，確保乳源真實(shí)性，建立一個(gè)特色乳品乳源檢測(cè)的評(píng)價(jià)體系是十分必要的。

現(xiàn)有報(bào)道的特色乳品乳源檢測(cè)的方法主要有核酸檢測(cè)[13-14]、色譜質(zhì)譜分析[15-17]、蛋白質(zhì)檢測(cè)[18]、免疫檢測(cè)[19-21]等。不同的方法因其特點(diǎn)不同，應(yīng)用場(chǎng)合也有所差別。如核酸與免疫檢測(cè)，適用于一線及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)大量樣本的初篩；質(zhì)譜和傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室研究方面應(yīng)用更為廣泛。Ren等[22]研制ELISA檢測(cè)試劑盒，可實(shí)現(xiàn)對(duì)牦牛乳中牛乳成分的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；Calleja等[23]研制的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)試劑盒可對(duì)羊乳中牛乳成分進(jìn)行快速檢測(cè)；Blasi等[24]通過(guò)對(duì)三酰基甘油的立體專(zhuān)一分析實(shí)現(xiàn)對(duì)驢奶、牛奶、綿羊奶、山羊奶和水牛奶的判定。Francisco等[25]通過(guò)元素含量測(cè)定結(jié)合函數(shù)計(jì)算，可對(duì)牛乳、山羊乳、綿羊乳進(jìn)行很好的區(qū)分。

乳及乳制品中富含蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分析也是對(duì)乳品真?zhèn)巍⑵焚|(zhì)以及性狀研究的重要手段。有研究表明，各種乳品的蛋白質(zhì)在種類(lèi)和含量上均存在一定差異[26]。毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)，在電壓的驅(qū)動(dòng)下將蛋白根據(jù)分子量進(jìn)行分離。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期也采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)乳品中的大豆蛋白成分[27]、羊乳嬰幼兒配方乳粉中的牛乳成分[28]均建立了檢測(cè)方法。說(shuō)明毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)可以作為乳品真實(shí)性判別的重要手段。本研究采用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)，通過(guò)篩選出驢乳、馬乳、駱駝乳、水牛乳、牦牛乳、牛乳、羊乳等多種乳的多個(gè)靶標(biāo)蛋白峰，以及判定標(biāo)準(zhǔn)，形成系列評(píng)價(jià)體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)常見(jiàn)乳源成分進(jìn)行檢測(cè)。并考察該方法在穩(wěn)定性、重復(fù)性以及靈敏度等方面的參數(shù)，并對(duì)市售樣品的檢測(cè)情況，初步驗(yàn)證了毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)作為多種特色乳品乳源檢測(cè)方法具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

標(biāo)準(zhǔn)樣品：水牛乳收集自廣西水牛研究所，馬乳和羊乳為實(shí)驗(yàn)室派員前往內(nèi)蒙古收集，駱駝乳委托內(nèi)蒙古海關(guān)技術(shù)中心收集，牦牛乳、牛乳委托中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)收集，驢乳委托山東海關(guān)技術(shù)中心收集；標(biāo)準(zhǔn)樣品均經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，確定其為標(biāo)準(zhǔn)樣品。市售乳制品購(gòu)自北京某超市。

1.1.2 主要試劑

毛細(xì)管電泳儀SDS-MW試劑盒，美國(guó)Sciex；BCA蛋白定量試劑盒，德國(guó)Merck；β-巰基乙醇，美國(guó)Sigma-Aldrich。

1.1.3 主要設(shè)備

PA800 plus毛細(xì)管電泳儀，美國(guó)Sciex；及光電二極管陣列檢測(cè)器，PDA檢測(cè)器，美國(guó)Sciex；5418R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；微量移液器，德國(guó)Eppendorf；超聲波清洗儀，國(guó)產(chǎn)；渦旋振蕩器，Genie公司；電子天平，Sar torius公司；水浴鍋。

1.2 蛋白濃度測(cè)定

使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定對(duì)各乳品標(biāo)準(zhǔn)樣品及市售樣品進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。所有樣品重復(fù)3次。在酶標(biāo)儀上560 nm讀數(shù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各樣品蛋白質(zhì)量濃度。

1.3 毛細(xì)管凝膠電泳方法

將樣品按照測(cè)定濃度將樣品稀釋至15 mg/mL，量取500μL液態(tài)乳樣品置于15 mL離心管中，加2%SDS樣品緩沖液7 mL，渦旋震蕩，至充分溶解。移液槍吸取稀釋后的樣品10μL于1.5 mL離心管中，加入1μL 10 ku內(nèi)標(biāo)蛋白溶液、85μL SDS樣品緩沖液，并在通風(fēng)柜中加入5μLβ-巰基乙醇，蓋緊瓶蓋、充分混合，于沸水浴中加熱3 min，取出后用常溫水沖洗冷卻30 s，上樣電泳分析。毛細(xì)管柱為50μm×30.2 cm非涂層石英毛細(xì)管。電泳步驟幾及條件如表1所示，采用檢測(cè)器為光電二極管陣列(PDA)檢測(cè)器，在4℃條件下檢測(cè)，獲取數(shù)據(jù)。

表1 毛細(xì)管電泳步驟及條件

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蛋白濃度測(cè)測(cè)定

測(cè)定牛乳、水牛乳、牦牛乳、驢乳、馬乳、羊乳、駱駝乳樣品的總蛋白濃度，每個(gè)樣品三次重復(fù)測(cè)定取平均值，發(fā)現(xiàn)駱駝乳、牦牛乳蛋白濃度較高，馬乳、驢乳蛋白濃度較低。為了保證不同乳品總蛋白濃度不對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，我們用蒸餾水對(duì)蛋白濃度大的乳樣品進(jìn)行適量稀釋?zhuān)蛊涞鞍诐舛燃s為15 mg/mL，并進(jìn)行總蛋白濃度測(cè)試，結(jié)果如表2所示。

表2 7種乳品蛋白濃度測(cè)定結(jié)果

2.2 不同乳品差異分析

2.2.1 不同乳品蛋白特征峰篩選

我們收集了真實(shí)屬性的牛乳、水牛乳、牦牛乳、驢乳、馬乳、羊乳、駱駝乳，采用優(yōu)化后的毛細(xì)管凝膠電泳方法對(duì)樣品的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分析，每個(gè)樣品進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以確保圖譜峰形穩(wěn)定可靠。結(jié)果如圖1所示。在馬乳和驢乳中，穩(wěn)定存在特征蛋白峰W3，而在其他乳品中均為出現(xiàn)，所以，W3可作為馬屬動(dòng)物乳源特征蛋白峰。通過(guò)對(duì)牦牛乳、水牛乳、奶牛乳等牛屬動(dòng)物電泳分析發(fā)現(xiàn)，3種乳中蛋白峰C4的相對(duì)遷移時(shí)間與其他乳不同，可作為牛屬動(dòng)物的特征蛋白峰。W2蛋白峰在駱駝乳中含量極低，根據(jù)前期研究，W2蛋白位于乳清蛋白區(qū)域，結(jié)合文獻(xiàn)研究[29-30]，駱駝乳中缺乏β-乳球蛋白，所以可以初步判定W2即為β-乳球蛋白，該蛋白可作為駱駝乳摻假的參考指標(biāo)。本課題組前期研究證明，C1蛋白，即為β-酪蛋白，是牛乳特征蛋白，與羊乳C1相對(duì)蛋白遷移時(shí)間不同，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛乳中該蛋白的相對(duì)遷移時(shí)間也與驢乳和馬乳中的不同。

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，分子量為14 ku左右的蛋白W1在兩種乳中均存在，根據(jù)分子量判別其為α-乳球蛋白（α-Lactalbumin,α-La）。駱駝乳中W1蛋白與W2蛋白的峰面積比值較大，牛乳中該峰面積比值較小。

圖1 牛乳、水牛乳、牦牛乳、驢乳、馬乳、羊乳、駱駝乳毛細(xì)管凝膠電泳圖譜

2.2.2 不同乳品差異因子分析

應(yīng)用SIMCA軟件，針對(duì)不同乳品主要蛋白的與10 ku內(nèi)標(biāo)的相對(duì)遷移時(shí)間，以及蛋白峰W1與W2的比值進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果如表3所示，采用主成分分析（PCA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，構(gòu)建模型，結(jié)果如圖2所示。我們發(fā)現(xiàn)，馬乳和驢乳主要性質(zhì)相近，與其他乳差異較大，駱駝乳與其他乳差異也較大。通過(guò)差異因子分析，我們確定W1、W2峰面積比為駱駝乳特征因子；W3蛋白峰為馬乳和驢乳特征因子；C4蛋白相對(duì)遷移時(shí)間為牛屬乳品特征因子。

圖2 不同乳品差異因子PCA聚類(lèi)分析模型

2.3 方法重復(fù)性及穩(wěn)定性

為考察毛細(xì)管凝膠電泳法的方法重復(fù)性與穩(wěn)定性，將牛乳標(biāo)準(zhǔn)樣品按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行毛細(xì)管電泳，進(jìn)行6次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，以及單次試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)樣6次，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖譜如圖3所示。對(duì)樣品圖譜進(jìn)行積分，計(jì)算出峰時(shí)間。重復(fù)性試驗(yàn)中，牛乳中15個(gè)蛋白峰與10 ku內(nèi)標(biāo)蛋白出峰時(shí)間差值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation,RSD）均不高于0.06。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，牛乳中15個(gè)蛋白峰與10 ku內(nèi)標(biāo)蛋白出峰時(shí)間差值的RSD均不高于0.03。

圖3 牛乳蛋白毛細(xì)管電泳圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 特色乳品檢測(cè)靈敏度

為考察所選定的三個(gè)特征蛋白峰的檢測(cè)靈敏度，由于牛乳成本最低，產(chǎn)量最大，為最主要摻假基質(zhì)，所以分別將相同濃度的驢乳與牛乳、駱駝乳與牛乳進(jìn)行梯度配比，使牛乳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、5%、10%、50%、100%，進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳分析，并進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

2.4.1 驢乳中牛乳成分檢測(cè)靈敏度

不同配比梯度驢乳與牛乳摻比樣品結(jié)果如圖4所示，驢乳特征蛋白W3在樣品中穩(wěn)定存在，且不與牛乳蛋白發(fā)生重疊。但是牛乳特征蛋白C4的靈敏度較低，僅能檢測(cè)到在含牛乳比例不低于10%的樣品。但是，我們發(fā)現(xiàn)C1蛋白，在含5%牛乳的驢乳樣品中蛋白峰明顯，可作為判別驢乳和馬乳中含有牛乳的判別依據(jù)。

圖4 不同配比梯度的驢乳樣品毛細(xì)管凝膠電泳圖譜

表3 不同乳品蛋白峰與蛋白內(nèi)標(biāo)相對(duì)遷移時(shí)間以及W1、W2蛋白峰峰面積比值結(jié)果

2.4.2駱駝乳中牛乳成分檢測(cè)靈敏度

不同配比梯度駱駝乳與牛乳摻比樣品結(jié)果如圖5所示，牛乳特征蛋白C4在樣品中穩(wěn)定存在，且不與駱駝乳蛋白發(fā)生重疊。但是駱駝乳中的牛乳特征蛋白C4靈敏度也較低，同樣是僅能檢測(cè)到在含牛乳比例不低于10%的樣品。同時(shí)，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用軟件積分，計(jì)算W1和W1蛋白峰的峰面積，計(jì)算W1蛋白峰與W1蛋白峰的峰面積比值，結(jié)果如表4所示。牛乳W1與W1的峰面積比值為0.322，駱駝乳W1與W1的峰面積比值為3.907，線性相關(guān)系數(shù)為0.9975。

圖5 不同配比梯度的駱駝乳樣品毛細(xì)管凝膠電泳圖譜

表4 樣品中W1蛋白峰與W1蛋白峰的峰面積比值

2.5 市售樣品檢測(cè)

圖6 市售乳品毛細(xì)管凝膠電泳圖譜

我們從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)了7個(gè)特色乳產(chǎn)品，按照建立的方法進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。可見(jiàn)，山羊乳粉和羊乳粉樣品中未檢測(cè)到與牛乳C1蛋白相對(duì)遷移時(shí)間相同的蛋白，判定其為羊乳產(chǎn)品；馬乳乳飲料樣品中，蛋白峰峰形不明顯，推測(cè)其經(jīng)過(guò)了強(qiáng)熱加工處理，蛋白水解嚴(yán)重，但是未見(jiàn)與牛乳C1蛋白相對(duì)遷移時(shí)間相同的蛋白，W3蛋白位置有蛋白峰，所以，初步判定其為馬乳制品；駱駝配方乳粉中，可見(jiàn)與牛乳C1蛋白相對(duì)遷移時(shí)間相同的蛋白，經(jīng)積分計(jì)算，W1與W2的峰面積比值為1.278，判別其中含有牛乳成分，凍干驢乳粉中，W3蛋白峰明顯，并且未出現(xiàn)與牛乳C1蛋白相對(duì)遷移時(shí)間相同的蛋白，判定其為驢乳制品；牦牛乳和水牛乳樣品中，C1蛋白和C4蛋白相對(duì)遷移時(shí)間與牛科動(dòng)物乳品特征一致，證明其為牛科動(dòng)物乳制品。

3 討論

現(xiàn)在對(duì)于特色乳品的物種判別檢測(cè)方法的研究已經(jīng)成為乳品真?zhèn)渭捌焚|(zhì)研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)在主要報(bào)道的檢測(cè)技術(shù)研究中，如Sachinandan等[31]采用單重和多重PCR法可對(duì)液態(tài)乳及乳酪中的水牛源與牛源成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1%，但是對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品或者混用生產(chǎn)線的乳制品容易造成假陽(yáng)性。Hurley等[20]開(kāi)發(fā)了一種基于間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法的牛乳成分快速檢測(cè)方法，可用于快速檢測(cè)羊奶、綿羊奶和水牛奶中的牛奶，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1%。但是免疫技術(shù)過(guò)于依賴(lài)抗體質(zhì)量，現(xiàn)今，特色乳品種類(lèi)越來(lái)越多，對(duì)于近源物種的乳品蛋白是否存在交叉反應(yīng)仍需進(jìn)一步確認(rèn)，而且對(duì)于特色乳品中的少量污染成分，以及復(fù)雜基質(zhì)的乳品容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。張?chǎng)蔚萚32]開(kāi)展研究，將93份牛乳、馬乳、山羊乳、駱駝乳及不同比例摻比樣品進(jìn)行脂肪酸指紋分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析構(gòu)建判別模型，模型判別準(zhǔn)確性可以達(dá)到90%。但是模型判別對(duì)于建模樣品要求很高，不便于檢測(cè)方法推廣。Katharina等[33]采用雙向電泳結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)駱駝乳缺乏β-乳球蛋白，并且可通過(guò)蛋白質(zhì)指紋圖譜比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)牛、山羊、水牛、馬和駱駝乳的區(qū)分。但是雙向電泳法操作繁雜，需要操作者有一定的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，并且耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)通量低，不適于大量檢測(cè)樣品的開(kāi)展。Ke X等[34]建立UHPLC-MS/MS法，可對(duì)羊乳嬰幼兒配方乳粉中的4種牛乳酪蛋白和2種牛乳乳清蛋白進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)定量限可達(dá)0.01～0.05 g/100 g，可對(duì)復(fù)雜基質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。但是，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備，設(shè)備成本高、對(duì)環(huán)境要求高，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員素質(zhì)要求也較高，不易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模推廣。毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好、重復(fù)性高，檢測(cè)快捷高效，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)蛋白的快速篩查。

本研究采用毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過(guò)對(duì)各乳品蛋白與10 ku內(nèi)標(biāo)蛋白相對(duì)遷移時(shí)間，以及W1和W2蛋白峰峰面積比值進(jìn)行聚類(lèi)分析，篩選出差異較大的多個(gè)靶標(biāo)蛋白峰，以及判定標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)常見(jiàn)乳源成分進(jìn)行檢測(cè)。初步建立了可實(shí)現(xiàn)馬科的驢乳和馬乳、駱駝乳、羊乳、和牛族動(dòng)物（牛、水牛、牦牛）乳的區(qū)別。經(jīng)過(guò)電泳分析，我們可以發(fā)現(xiàn)，驢乳和馬乳出峰時(shí)間、峰面積比值基本相同，所以我們選取驢乳為研究對(duì)象，分析馬乳和驢乳與牛乳蛋白差異，蛋白W3穩(wěn)定存在馬乳和驢乳中，可作為馬乳和驢乳靶標(biāo)蛋白；此外，結(jié)合本次試驗(yàn)以及前期研究，牛族動(dòng)物（牛、水牛、牦牛）乳特征蛋白C1和C4相對(duì)遷移時(shí)間可作為判定牛乳蛋白的靶標(biāo)蛋白。本研究未找到駱駝乳特征蛋白，但是駱駝乳中β-乳球蛋白含量較低，其常見(jiàn)摻假乳品—牛乳的β-乳球蛋白含量較高，并且摻假現(xiàn)象主要是經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)，摻假比例過(guò)低無(wú)法獲得經(jīng)濟(jì)效益，所以，選定10%為檢測(cè)限，W1與W2的峰面積比值不低于3.5，并且存在C4蛋白則說(shuō)明駱駝乳中摻雜牛乳。

但是，隨著人民生活水平的提高與乳品營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的深入，牦牛乳、水牛乳等乳品也以其致敏性較低、營(yíng)養(yǎng)豐富[35-36]等特點(diǎn)，越來(lái)越受到人們青睞，但是本研究建立的方法還無(wú)法對(duì)牛、水牛、牦牛乳進(jìn)行很好的區(qū)分，后面的研究中，我們將通過(guò)嘗試毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管膠束電泳等電泳模式，對(duì)其進(jìn)行區(qū)分研究。同時(shí)，現(xiàn)在所構(gòu)建的聚類(lèi)模型由于數(shù)據(jù)量有限，無(wú)法進(jìn)行樣品識(shí)別，后期我們將擴(kuò)充樣本量，研究構(gòu)建判別模型。

4 結(jié)論

本研究采用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)，計(jì)算各乳品蛋白峰與內(nèi)標(biāo)蛋白相對(duì)遷移時(shí)間，構(gòu)建聚類(lèi)分析模型，篩選特色乳品及牛乳的多個(gè)靶標(biāo)蛋白峰以及判定標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)常見(jiàn)乳源成分進(jìn)行的檢測(cè)，方法精密度和重現(xiàn)性良好。在對(duì)市售特色乳品樣品檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)高比例的摻假產(chǎn)品。