CircRNA進展

湯博藝

（西藏大學理學院，西藏拉薩 850012）

1976年，Sanger等[1]提出一種“共價閉合環狀單鏈RNA”的類病毒，這是人類首次證明環狀RNA（Circular RNAs，CircRNA）的存在。隨后人們相繼在酵母細胞、小鼠睪丸、人體成纖維細胞內發現CircRNA。自90年代末起，更多的CircRNA證明與人類的細胞色素P450基因、人類抗營養不良基因、人類細胞周期蛋白依賴性激酶4（INK4/ARF）等基因有關。這些早期的研究清楚地證明了環狀RNA分子的存在，但其潛在價值尚未發掘。

自2010年起，隨著RNA測序技術和生物信息學技術的進步，關于CircRNA的研究開始高速發展。使用RNase R（一種來源于大腸桿菌RNR超家族的3'～5'核糖核酸外切酶）[2]預處理，分析無聚腺苷酸富集的CircRNA文庫，不僅可以富集CircRNA，還可以將真實的CircRNA與帶有折疊錯誤的mRNA區分開來。目前，多項研究揭示了CircRNA在人類、小鼠和果蠅中以組織和發育階段特異性的方式進行表達，并與免疫應答、癌癥發生等生理病理過程相關，可以作為疾病診斷的生物靶標。

1 CircRNA的分子結構

CircRNA不具5'末端帽和3'末端poly（A）尾，是一類共價環狀內源ncRNA，主要具有以下特征：（1）在真核生物的組織細胞中表達相當豐富，且表達具有組織特異性和時空選擇性，CircRNA在某些人體組織中的分子總量甚至達線性RNA的10倍以上；（2）CircRNA對核酸酶具有抗性，穩定性較ncRNA更強，并且大多CircRNA的進化十分保守；（3）CircRNA通常包含完整的外顯子，位于細胞質中，只有少數CircRNA由內含子環化而成，位于細胞核中。

2 CircRNA的生物起源

CircRNA由前體mRNA（pre-mRNA）產生，并由RNA聚合酶Ⅱ轉錄。目前，發現的CircRNA可以根據其不同的組成和循環機制簡單地分為3種類型：外顯子CircRNA（EcircRNA）、內含子CircRNA（CiRNA）和外顯子-內含子CircRNA（EIciRNA）。

2.1 EcircRNA

EcircRNA通過外顯子的反向剪接形成。目前，有3種假設模型解釋EcircRNA的發生：外顯子跳讀、內含子配對驅動環化和RNA結合蛋白（RBP）介導的環化。如圖1所示，在形成EcircRNA時，premRNA在轉錄過程中發生部分折疊，外顯子隨RNA折疊而跳躍，形成“套索結構”，在套索結構內通過剪接去除內含子序列后形成CircRNA，這種方式稱為“外顯子跳讀”；由pre-mRNA兩側內含子上的反向互補序列配對形成CircRNA稱為內含子配對驅動環化；此外，一些RNA結合蛋白被發現在環狀RNA的形成中起關鍵作用[2]。ADAR1是一種RNA編輯修飾酶，不僅能編輯修飾RNA，還可以通過靶向定位人類細胞中的雙鏈Alu重復序列結合雙鏈RNA，從而具有RBP（視黃醇結合蛋白）功能，因此ADAR1可通過干擾RNA配對抑制CircRNA形成。DHX9是一種豐富的核RNA解旋酶，具有一個類似于ADAR的特殊結構域。沉默DHX9通常通過解開環狀外顯子側面的RNA雙鏈來增加環狀RNA的產量。

2.2 CiRNA

多數內含子形成套索結構時迅速被去分支酶降解。然而，在Hela細胞和人胚胎干細胞中有一些包含位于5'端的GU重復序列和位于分支點的CC重復序列的內含子能逃避去分支酶的降解，形成ciRNA。

2.3 EIciRNA

兩個以上的EcircRNA環化時，內含子切除不完全可產生EIciRNA。EIciRNA主要位于細胞核中。

3 CircRNA功能

3.1 CircRNA充當microRNA海綿

CeRNA假說表明，microRNA可以結合在靶基因上，在轉錄后水平影響mRNA的穩定性和轉錄；然而，microRNA自身又受到ceRNA的調控。許多CircRNA具有不同類型和數量的microRNA結合位點，從而具有microRNA海綿效應，降低microRNA活性并上調microRNA相關靶基因的表達，發揮高效ceRNA功能。例如，小腦退行性相關蛋白基因1（CDR1）的CircRNA分子（CDR1as-ciRS-7）有超過60個保守的miRNA-7結合位點。在人類和小鼠腦組織中，ciRS-7作為miR-7的分子海綿，抑制miRNA miR-7與靶基因CDR1的結合，進而正向調控miR-7靶基因。

圖1 Circ RNA的三種剪切方式

然而，特定CircRNA豐度（除了果蠅的MBL和人類的CDRIas）通常較低，這與經典的CircRNA-microRNA海綿假說似乎相矛盾。因為microRNA的表達十分豐富，microRNA與靶基因的結合位點也遠比與CircRNA結合的位點更多，這大大降低了CircRNA與microRNA結合的可能性。因此CircRNA還可能發揮催化作用，直接激活、降解或滅活microRNAs，但此猜想尚無明顯證據。

3.2 CircRNA調節基因轉錄

除充當MicroRNA海綿外，一些ciRNAs和EIciRNAs還可以通過轉錄或轉錄后的方式調控基因表達來調控蛋白質的產生。EIciRNAs可與U1小核核糖核蛋白（U1-small nuclear ribonucleo protein，snRNP）相互作用，通過與RNApolⅡ結合，促進親代基因轉錄。此外，一項研究發現，剪切因子MBL的第2個外顯子可發生環化，以CircMbⅠ的形式與premRNA通過線性剪切競爭，影響線性RNA的形成，調控相關基因的表達。

3.3 CircRNA與腫瘤相關

CircRNA對腫瘤具有抑制作用。Shang等[3]發現，hsa_circ_0005075的表達在肝癌組織和正常組織存在差異，其表達和腫瘤大小有密切關系，并展示出良好的診斷潛力。Li等[4]研究發現，hsa_circ_002059作為一種典型的circRNA在胃癌組織中低表達，與胃癌轉移、TNM分期、性別和年齡等密切相關。因此，CircRNA有望作為一種新型的生物標志應用于腫瘤的診斷。

4 CircRNA研究面臨的挑戰

隨著測序技術和生物信息學的發展，越來越多的CircRNA逐漸被發現，成為RNA領域的研究熱點。然而，CircRNA的研究仍然面臨許多挑戰。（1）目前國際上對于CircRNA并沒有統一的命名約定，極易造成混淆。（2）目前，關于CircRNA的數據庫還不完善。雖然研究人員可以通過多個數據庫預測CircRNA的功能，但是還沒有與腫瘤預后相關的CircRNA數據庫，在RNA-seq后功能CircRNA的篩選方面面臨困難。

5 結語

CircRNA的發現豐富了人們對生物進化的認識，加深了對非編碼RNA家族的理解，為研究腫瘤的發生發展提供了新的方向。雖然目前對于CircRNA在腫瘤中形成、轉運和功能的確切機制的認識還非常有限，但是隨著新技術的應用和科學家的不斷努力，相信與CircRNA有關的未知之謎終將被揭曉答案。