植物病原菌對SDHI類殺菌劑抗性研究進展

李培謙，楊 瑾，馮寶珍

(運城學院 生命科學系，山西 運城 044000)

琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)也被稱為復合體II(Complex II)或琥珀酸泛醌還原酶(succinate-ubiquinone oxidoreductase,SQR)，是真菌呼吸鏈的重要組分，該復合體由四個亞基組成，即黃素蛋白(SdhA)、鐵硫蛋白(SdhB)及兩個膜錨定蛋白(SdhC和SdhD)[1]。琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI)類殺菌劑通過覆蓋線粒體復合體II輔酶Q位點，阻斷電子由鐵硫中心向輔酶Q傳遞，從而干擾真菌的呼吸作用，阻礙其能量代謝，抑制病原菌的生長，導致其死亡[1,2]。由于SDHI類殺菌劑獨特的作用模式，與其他殺菌劑甲氧基丙烯酸酯類(Strobilurin)、苯并咪唑類(benzimidazoles)以及苯胺嘧啶類(anilinopyrimidines)不存在交互抗性，曾經是抗藥性管理和病害防治的最佳選擇[3,4]。第一代SDHI類殺菌劑于上世紀60年代末上市如萎銹靈(carboxin)主要用于防治銹病和菌核病，而對其他病原菌的防治報道很少[5]。新一代SDHI類殺菌劑主要成分諸如啶酰菌胺(boscalid)、氟吡酰菌胺(furametpyr)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、thifluzamide、bixafen以及isopyrazam、penflufen等具有廣泛的殺菌譜可用于多種作物[3,6]。但是由于作用位點單一，以及高頻廣泛應用促使大田病原菌群體產生選擇抗性。新一代SDHI類殺菌劑，大大改善了病害防控效果，然而上市不久很多大田病原菌對其產生了抗性[7]。本文綜述了植物病原真菌對SDHI類殺菌劑抗性的機制及進化情況，對此類殺菌劑的應用和開發提出建議。

1.SDHI類殺菌劑的作用方式和靶標位點

SDHI類殺菌劑的靶標是呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶復合體(即復合體II，或琥珀酸泛醌還原酶SQR)[2]。有氧呼吸過程中，琥珀酸脫氫酶復合體將線粒體基質中的琥珀酸氧化為延胡索酸，同時將線粒體膜上疏水電子載體泛醌(UQ)還原為UQH2[8]。除了在呼吸系統中起到脫氫酶作用，SDH在三羧酸循環中也起到重要作用。線粒體SDH復合物由膜周邊結構域和膜錨定結構域組成(圖1)。復合體的外圍區域有兩個親水性的亞基組成SDHA和SDHB，形成復合體的可溶性部分并且具有琥珀酸脫氫酶活性，將琥珀酸氧化為延胡索酸。SDHA是一種黃素蛋白(Fp)，具有共價的FAD共因子，是催化部位的一部分。SDHB是一種鐵硫蛋白(Ip)，具有三個不同的鐵硫簇，為FAD與膜醌間電子傳遞服務(圖1)[9,10]。

圖1 復合體II亞基結構及酶活性[10]

各物種中Fp和Ip基因序列高度保守，說明是由共同的祖先基因進化而來[9]。整個膜錨定區域由兩個疏水蛋白亞基SDHC和SDHD組成。除蛋白外組分外，復合體II還包含一個血紅素b基團，復合于SDHC和SDHD之間[9,11]。由于血紅素b含量差異和序列同源性很低，致使疏水膜域存在多樣性。膜錨定區域包含泛醌還原和抑制劑的結合位點，并將催化亞單位(Fp和Ip)固定在線粒體內膜上，從而促進電子向輔酶醌的傳遞[12]。SDHI類殺菌劑通過覆蓋泛醌位點阻斷電子由[3Fe-4S]向輔酶Q傳遞來干擾呼吸[8,13]。

2. SDHI類殺菌劑抗性分子機制

2.1 萎銹靈抗性

多種病原物已對萎銹靈及其結構類似物產生了抗性，而且抗藥性源于病原菌SDH基因突變。玉米黑粉病Ustilagomaydis對萎銹靈的抗性是由于SDHB基因上保守的257位組氨酸殘基突變為酪氨酸或亮氨酸引起(9H257Y/L)[14]。對大腸桿菌Escherichia coli泛醌結合位點(Q位點)結構分析顯示存在兩個潛在的結合位點；其中一個潛在的Q位點與保守的組氨酸殘基非常接近，表明了組氨酸在泛醌結合和還原中起作用[8]。該研究中還發現萎銹靈與泛醌在保守組氨酸(H207)附近以同樣的方式結合，這些結果足以說明組氨酸殘基與SDHI類殺菌劑結合的重要性。禾生球腔菌Mycosphaerellagraminicola中SDHB基因突變H267L/Y導致了對萎銹靈的抗性[15]。在Xanthomonascampestris中SDHB基因第229位組氨酸突變導致抗性產生[16]。有些報道表明，萎銹靈抗性還與膜錨定蛋白SDHC和SDHD突變有關[1]。擔子菌Coprinuscinereus對氟酰胺抗性菌株的SDHC基因發生點突變，80位天冬酰胺被賴氨酸取代N80K[1]，該突變株對萎銹靈表現出交叉抗性。已經從稻瘟病菌分離到萎銹靈抗性菌株，并鑒定了(SDH)B、C和D亞基的三個基因位點的突變情況，它們均與抗藥性有關[17]。

2.2 啶酰菌胺抗性

大田和實驗室關于絲狀真菌對啶酰菌胺的抗性早有報道(見表1)。很多學者已對啶酰菌胺抗性機制進行了研究，基因測序結果表明抗性產生是sdhB、sdhC和sdhD氨基酸殘基突變造成的。

表1 對SDHI類殺菌劑抗性植物病原菌適應度變化

有研究表明Alternariaalternata對啶酰菌胺抗性源于sdhB發生S221P、H267N/Y、H272Y/R突變和sdhDD129E突變，并且對啶酰菌胺表現高抗水平性的菌株對萎銹靈存在交互抗性[18]。馬鈴薯早疫病(A.solali)sdhC及sdhD基因發生突變引起對啶酰菌胺的抗性的產生[19]。對黃瓜褐斑菌(Corynesporacassiicola)抗性菌株測序發現sdhB基因發生H278Y突變[20]，后來的研究還發現該菌sdhC或sdhD基因突變都能導致對啶酰菌胺抗性[21]。

對大田啶酰菌胺抗性的灰葡萄孢B.cinerea菌株測序發現，sdhB基因同時存在兩個位點突變，即H272Y/R和P225L/T/F。分子建模研究表明所有的突變氨基酸都位于或靠近泛醌結合位點，突變導致了與SDHI類殺菌劑親和力的下降或喪失[3]。對大田灰霉菌(Botrytiscinerea)啶酰菌胺抗性菌株分析發現sdhB基因除了H278R突變外，還出現了H267L/R、P225F/L、N230I等多位點突變[22,23]。灰霉菌sdhD基因272位組氨酸突變為亮氨酸(H272L)、230位天冬氨酸突變為亮氨酸(N230I)以及132位組氨酸突變為精氨酸(H132R)也能導致病原菌抗性的產生[24]。林澤松等對果蔬灰霉病抗性菌株分析發現啶酰菌胺抗性菌株的琥珀酸脫氫酶B亞基發生了3處突變包括H272R、P225F和N230I，其中H272R型突變為主要類型；同時C亞基的發生了4種突變[25]。劉欣等利用AS-PCR分析了上海地區草莓灰霉菌抗性菌株發現sdhB基因發生了P225F、N230I、H272R和H272Y 4種突變類型[26]。此外，Li et al.也發現草莓灰葡萄孢啶酰菌胺抗性菌株以B亞基H272R突變為主[27]。

此外，實驗室紫外誘變Penicilliumexpansum菌株對boscalid高抗，測序分析其B亞基發生了點突變H272R/Y[28]。

由于sdhB基因在生物體內高度保守，各種病原菌中突變的組氨酸殘基也是保守的。比如A.alternata中His277與B.cinerea的His272、U.maydis的His257、M.graminicola中His267以及X.campestris中His229是相對應的[29]。盡管各物種錨定蛋白基因sdhC和sdhD同源性很低，但是泛醌結合位點的氨基酸卻非常保守，突變的氨基酸可能參與殺菌劑的結合作用[29]。

2.3 其他

通過紫外線誘導獲得了對多種SDHIs具有抗性的5個Ramulariacollo-cygni菌株，并對琥珀酸多氫酶亞基測序結果顯示sdhC發生H142R突變的菌株對boscalid高抗(RF=1114)，而對另外4種SDHIs(bixafen、isopyrazam、carboxin和fluopyram)表現中抗(16

3. 抗性突變體檢測方法

3.1 生物測定法

殺菌劑抗性監測對于評估藥效和揭示病原菌敏感性早期轉變是必不可少的，也可為殺菌劑施用提供建議。

抗藥性監測的第一步是建立病原菌對某一殺菌劑的敏感基線[33]。利用傳統的生物測定法測定了多種病原物對SDHIs的敏感基線，并檢測到多種重要病原體的抗性菌株。利用微量滴定板液體培養基中菌絲生長測定法，作為建立基線靈敏度和監測殺菌劑抗藥性的方法。比如Sclerotiniasclerotiorum[3]、灰葡萄孢[34]核盤菌及Moniliniaspp.[35]等都是利用此法測定的。還可以利用含有藥的平板測定菌絲生長速率和分生孢子萌發法來檢測敏感性，如Alternariaspp.[36]、B.cinerea[4,37,38]、R.cerealis[31]以及P.expansum[28]等都是利用此類方法測定敏感性。敏感基線的建立不僅促進了利用單一鑒別劑量的殺菌劑進行快速體外監測程序發展，而且還適用于廣泛的監測研究。

3.2 分子檢測法

傳統的殺菌劑抗性測定方法費時費力，而利用DNA分析可以快速準確地檢測病原菌群體中抗性等位基因的突變情況以進行抗性風險評估。DNA檢測技術的應用可以改善風險評估，優化抗性管理，以及新農藥產品的推廣普及。利用限制性片段長度多態性(RFLP)、等位基因特異性(AS-PCR)以及微衛星引物分析(MP-PCR)等手段都可以檢測抗性菌株靶標基因突變情況。利用RFLP能夠分析鏈格孢對啶酰菌胺抗性的不同基因突變類型H277R、H133R、H134R、D123E[18]。通過AS-PCR可以分子診斷鏈格孢SDHB基因發生的H277R/Y突變以及SDHC基因的H134R突變[18]。利用AS-PCR分析了抗啶酰菌胺灰葡萄孢sdhB基因序列發生的抗性突變類型[25,26]。Yin et al.利用MP-PCR區分了對啶酰菌胺抗性灰葡萄孢H272R/Y突變的菌株[37]。此外，利用同源克隆法分析啶酰菌胺抗抗性菌株sdhA、sdhB、sdhC和sdhD基因序列發現sdhB基因發生點突變[27,39]。利用分子診斷方法，對180個鏈格孢的啶酰菌胺抗性菌株檢測，發現發生H277Y或H277R突變的菌株分別達到45%和35%。只有5個菌株C基因發生了H134R突變。并且分子診斷分析與傳統分析的結果一致，更說明了作為常規檢測方法，分子檢測準確性和可靠性[29]。

4.SDHI啶酰菌胺抗性菌株的適應度評估

適應度是生物個體在環境中生存的能力，這種能力能夠遺傳給下一代[40]。適應度既可以衡量個體在環境中的表現，也可以比較群體中不同個體的表現差異。植物病原真菌的適應度組成項目通常包括孢子的形成萌發、菌絲生長、致病性、突變類型、呼吸速率、酶活性以及種群結構等方面[22,23,41,42]。在殺菌劑選擇壓力下，病原菌抗藥性的產生伴隨著適應度代價[43]。因此，從適合度角度描述抗藥菌株對于預測未來整個種群的行為和實施病害控制策略是至關重要的。目前很多學者都對病原菌適應度進行了研究，但由于試驗條件差異以及評判標準不同致使實驗結果迥異(見表1)。

鏈格孢實驗室突變體sdhB(S221P、H267N、H267Y)和sdhD(D129E)類型菌絲在正常條件下生長速率無明顯變化，但是在氧化壓力下生長速率降低[18]。田間鏈格孢突變株sdhD-D123E類型產孢量下降，氧化敏感性增強，而其他類型如B-H277Y/R、C-H134R和D-H133R突變菌株無適應度變化[44]。sdhD-D123E,sdhB-H277/8 Y/R,sdhC-H134R,及sdhD-H133R突變的菌株中也沒有發現菌絲生長速率及分生孢子活力變化[36]。實驗室獲得的Z.tritici抗性菌株線粒體呼吸速率明顯降低，但在菌體生長速率及致病性方面無明顯變化[45]。據報道，大田Corynesporacassiicola和D.bryoniae抗/感菌株的致病性不存在差異[29]。Ramulariacollo-cygni和P.expansum抗性突變菌株致病力無明顯變化[30,46]。然而，Rhizoctoniasolan突變體菌核產量和致病力均明顯下降[29]。

大田和實驗室條件下對灰霉菌適應度研究結果迥異。有研究發現H272R/Y/L、P225F和N230I突變型菌株在菌絲生長速率、產孢量、菌核產量以及對滲透壓敏感性方面與敏感性菌株間無明顯差別[38]。而競爭分析試驗研究中發現H272R/Y/L,N230I,和P225F突變型菌株的適應度均低于敏感性菌株[23]。等位基因轉化試驗發現H267L/R菌株在一定培養基上高溫下生長較慢，但在基本培養基上的低溫下生長較快；P225L/H272R型轉化子菌核產量明顯減少[22]。有些病原菌的sdhB突變株對氟吡菌酰胺沒有交互抗性或者表現負交互抗性，但是其他的突變類型，特別是sdhC突變菌株對現有的SDHI都表現高抗[45]。實驗室內分析往往檢測菌體生長速率或者無性孢子產量方面明顯的變化，然而對于較小的適應性差異，需要采用靈敏度更大的競爭分析法。競爭分析法更貼近自然條件，將抗性和敏感性菌株按一定比例混合侵染大田寄主，然后qPCR法測量抗性菌株等位基因含量[49]。競爭分析法更能評估病原菌群體總的適合度，對今后適合度評估具有重要現實意義[41]。然而，迄今還沒有關于就抗性風險評估的適應度測定方法的統一標準。

5. 研究展望

通過了解與抗性起源、發展和傳播有關的因素，可以在最大程度上實現有效的抗性預防和策略制定。盡管殺菌劑抗藥性是限制藥效和使用壽命的一個關鍵因素，但是抗性也有助于我們在分子水平上了解殺菌劑的作用機制。利用分子遺傳技術，已經在病原菌的靶基因中發現與SDHI抗性相關單個核酸多態性。新的SDHI殺菌劑已經開發出來，其中一些與現有的SDHI具有不同的交互抗性模式。殺菌劑的內在活性是基于對目標位點的特異性和親和力和結合強度。SDHI殺菌劑活性的差異可能是由于它們與抑制劑結合位點中琥珀酸脫氫酶亞基中氨基酸殘基的結合親和力或相互作用的差異所致。對真菌病原菌中SDH基因氨基酸突變情況的了解有助于對這類殺菌劑抗性機制的認識。這將促進發展快速可靠的分子診斷技術，以便在大范圍內仔細監測對SDHI殺菌劑的抗性，并進一步幫助設計抗性管理策略，以及針對特定真菌病原體UQ位點的活性成分替代抑制劑。