乙型肝炎病毒促進肝細胞PD-L1蛋白表達機理

朱海珍 荀圳 鄧日林 田仁云 郭萌萌 陳生穩(wěn) 劉倩 郭艷霞

摘 ? 要：為了研究乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）能否借助腫瘤細胞的抗免疫機制來逃逸機體免疫，利用HBV感染去肝細胞，研究受感染后的肝細胞對宿主免疫應答的變化. 通過實時熒光定量PCR的方法分析HBV感染后的肝細胞內Axin和PD-L1的轉錄水平，發(fā)現(xiàn)HBV不影響Axin和PD-L1的轉錄水平，采用蛋白免疫印跡技術發(fā)現(xiàn)HBV能下調肝細胞內Axin蛋白水平，同時上調PD-L1蛋白水平. 進一步在細胞內轉染表達HBV的組成蛋白的質粒，通過蛋白免疫印跡技術發(fā)現(xiàn)HBV的組成蛋白HBx能下調細胞內Axin蛋白的表達. 通過數(shù)據(jù)相關性分析以及泛素化實驗發(fā)現(xiàn)，Axin能通過增加PD-L1的E3泛素連接酶SPOP的表達，促進PD-L1泛素蛋白酶體降解. 進一步對PD-L1的泛素化方式進行探討，發(fā)現(xiàn)Axin促進PD-L1的K48依賴的泛素化降解作用. 結果表明，HBV可能通過HBx下調Axin和SPOP蛋白水平，抑制PD-L1泛素化降解，進而逃逸宿主免疫應答. 本研究揭示了HBV免疫逃逸新機制，為治療HBV奠定了新的基礎，在一定程度上推動了抗HBV藥物開發(fā).

關鍵詞：酶;PD-L1;乙型肝炎病毒;Axin;免疫逃逸;泛素化;HLCZ01細胞

中圖分類號：Q71 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A

Mechanism of Induction of PD-L1

by Hepatitis B Virus in Human Hepatocytes

ZHU Haizhen1，2，3?，XUN Zhen1，2，3，DENG Rilin1，2，3，TIAN Renyun1，2，3，

GUO Mengmeng1，2，3，CHEN Shengwen1，2，3，LIU Qian1，2，3，GUO Yanxia1，2，3

（1. College of Biology，Hunan University，Changsha ?410082，China;

2. Institute of Pathogen Biology and Immunology，Hunan University，Changsha ?410082，China;

3. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract：In order to explore whether Hepatitis B virus （HBV） can escape the body’s immunity by means of the anti-immune mechanism of tumor cells， this study used HBV to infect hepatocytes， and then explored the changes of the immune response of infected hepatocytes to the host. The transcriptional levels of Axin and PD-L1 in hepatocytes after HBV infection were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR， and it was found that HBV did not affect the transcriptional levels of Axin and PD-L1. Then， western blot was used to find that HBV could down-regulate Axin protein levels in hepatocytes and up-regulate PD-L1 protein levels. Further transfection of plasmid expressing HBV component protein in cells showed that HBx could down-regulate Axin protein expression in cells by western blot. Data correlation analysis and ubiquitin assay showed that Axin promoted pD-L1 ubiquitin proteasome degradation by increasing the expression of E3 ubiquitin ligase SPOP of PD-L1. Further studies on the ubiquitination of PD-L1 showed that Axin promoted the K48-dependent ubiquitination of PD-L1. Based on the above results， we believe that HBV may down-regulate Axin and SPOP protein levels through HBx， inhibit PD-L1 ubiquitination and degradation， and then escape the host immune response. This study reveals a new mechanism of HBV immune escape， lays a new foundation for the treatment of HBV， and promotes the development of anti-HBV drugs to a certain extent.

Key words：enzymes;PD-L1;Hepatitis B virus（HBV）;Axin;immune evasion;ubiquitin;HLCZ01 cell line

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一種小的嗜肝DNA病毒，是導致慢性肝病的主要原因，可導致病毒性肝炎、肝硬化和肝細胞癌（Hepatic cell carcinoma，HCC）. 據(jù)統(tǒng)計，全世界約有2.5億人長期感染HBV，并有發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的風險[1]. 病毒和宿主因素都對慢性HBV感染的結果有影響，與其他病原體一樣，HBV形成了逃避宿主的免疫防御策略，例如高比率的基因突變率和免疫調節(jié)蛋白的表達.

軸抑制蛋白Axin是Wnt/β-catenin信號的負調節(jié)因子，通過蛋白酶體降解途徑調節(jié)β-catenin蛋白水平，進而抑制Wnt/β-catenin信號轉導[2-4]. 然而，Axin在HBV感染過程中的作用尚不清楚.

PD-L1是一種免疫檢查點分子，調節(jié)Ⅰ型T輔助細胞（Th1）免疫反應，介導癌癥免疫逃避. 它可以在腫瘤細胞（TC）和腫瘤浸潤性的免疫細胞（IC）上進行表達[5]. 近幾年，抗PD-L1治療手段在人類癌癥的免疫治療中占據(jù)了中心地位[6-8]. 然而，PD-L1在HBV感染中的作用及其機理仍有待闡明.

泛素蛋白酶體降解途徑是目前已知的所有真核生物體內具有高度選擇性且最為重要的蛋白質降解途徑. 真核細胞內泛素化修飾后的靶蛋白能被降解或者被轉移到細胞內或細胞外的特定部位. 靶蛋白的泛素化修飾需要E3泛素連接酶的參與，E3泛素連接酶通過調控調節(jié)蛋白的泛素化過程參與細胞內的多種生理過程[9]. 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可對細胞內多種生命活動產(chǎn)生影響，如影響轉錄因子的表達，促使Caspase剪切從而促使細胞凋亡等. 然而，HBV是否能調節(jié)細胞內一些E3連接酶的表達，進而調節(jié)泛素蛋白酶體途徑尚不清楚.

本文從轉錄水平、翻譯水平以及翻譯后的修飾水平對Axin 和PD-L1的關系進行了探討，發(fā)現(xiàn)Axin可能通過調節(jié)PD-L1的E3連接酶的表達，調控PD-L1的翻譯后修飾;同時，還發(fā)現(xiàn)Axin能夠逆轉HBV引起的PD-L1上調現(xiàn)象. 本研究為HBV免疫逃逸機理提供參考和依據(jù).

1 ? 材料與方法

1.1 ? 細胞系

Huh7細胞為美國耶魯大學醫(yī)學院劉晨教授實驗室惠贈;BGC-823購自Boster公司;HEK293T購自美國ATCC;HLCZ01細胞系由本實驗室從臨床病人肝組織中分離培養(yǎng)得到[10].

1.2 ? 試 ? 劑

高糖（DMEM）培養(yǎng)基和DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Invitrogen 公司），1×PBS（Hyclone 公司），0.25%胰蛋白酶（Invitrogen公司），細胞RNA收取Trizol 試劑（Invitrogen 公司），逆轉錄試劑盒（Accurate Biology公司），SYBR Green 定量試劑盒（Accurate Biology 公司），蛋白酶抑制劑片劑（Merck 公司），細胞蛋白收取RIPA 裂解液（Thermo 公司），Axin抗體（CST公司），PD-L1抗體（Proteintech公司），F(xiàn)lag抗體（Sigma-Aldrich公司），V5抗體（Invitrogen公司），β-actin 抗體（Sigma-Aldrich公司）.

60 mm的細胞培養(yǎng)皿（Biologix公司），十二孔細胞培養(yǎng)板（Biologix公司），10 cm的細胞培養(yǎng)皿（Biologix公司），1.5 mL的離心管（Axygen公司），200 μL PCR八聯(lián)管（Axygen公司），0.22 μm和0.45 μm的PVDF 膜（Merck Millipore公司）.

1.3 ? 儀器設備

4 ℃冰箱（中科美菱公司），-20 ℃冰箱（Haier公司），-80 ℃超低溫冰箱（Thermo公司），CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），生物安全柜（Airtech公司），凝膠核酸成像（上海天能公司），蛋白核酸曝光成像儀器（Bio-rad公司），細胞計數(shù)儀（Beckman公司），光學顯微鏡（Olympus公司），細胞液氮凍存罐（Thermo公司），分析天平（上海天平儀器廠），Nanodrop2000（Thermo公司），實時熒光定量PCR儀（湖南達爾儀器有限公司），普通PCR儀（Eppendorf公司），制冷高速離心機（Eppendorf公司）.

1.4 ? 實驗方法

1.4.1 ? HBV感染方法

用于實驗感染細胞的HBV來自HepG2.2.15細胞上清（D型）. 在培養(yǎng)HepG2.2.15細胞時，在培養(yǎng)基中加入終質量濃度為500 μg/mL的新霉素（G418）來維持HBV基因組的復制水平. 當HepG2.2.15細胞開始產(chǎn)生病毒時，用不加G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2.2.15細胞，一邊擴大培養(yǎng)細胞一邊收集細胞上清，收集的細胞上清用0.45 μm微孔過濾器過濾，使病毒得以富集，最后測定病毒滴度. HBV按照MOI為20接種于HLCZ01細胞，病毒與細胞孵育過夜后，去除培養(yǎng)上清，用磷酸鹽緩沖鹽水（Phosphate Buffered Saline，PBS）洗滌3次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至對應的時間點.

1.4.2 ? 過表達質粒的構建與鑒定

為了構建Axin、PD-L1、SPOP、Cbl和HBX的過表達質粒，首先利用Primer Primer5設計PCR引物，然后從Huh7細胞中提取總RNA，利用其逆轉錄產(chǎn)物為模板來擴增Axin、PD-L1、SPOP、Cbl基因;同時從HBV感染的HLCZ01細胞內提取細胞總RNA來擴增HBX基因. 通過膠回收純化PCR產(chǎn)物，最后利用TA克隆方法將擴增得到的DNA片段連入p3×Flag-CMV和pCDNA3.1a載體中，從而得到重組質粒p3×Flag-CMV-Axin、p3×Flag-CMV-PD-L1、p3×Flag-CMV-HBx、pCDNA3.1a-PD-L1、pCDNA3.1a-SPOP、pCDNA3.1a-Cbl，通過測序鑒定目的基因序列是否完全正確. PCR引物序列如表1所示.

1.4.3 ? Western blot實驗

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA Buffer裂解液裂解細胞，冰浴30 min，13 200 r/min離心15 min后收集蛋白. 根據(jù)試劑說明書的使用方法，用BCA（Bicinchoninic Acid）試劑法測定蛋白濃度. 取20 μg蛋白樣品與2×Load ?Buffer等體積混合，在100 ℃金屬浴中煮沸5 min之后上樣，采用80 V恒壓跑膠，待蛋白Mark分層后調至120 V恒壓跑膠，根據(jù)Mark顯示的位置，待目的蛋白到達合適位置后進行轉膜. 100 V恒壓轉膜2 h，轉膜成功后，以5%的脫脂牛奶封閉1 h，之后加入對應一抗4 ℃過夜孵育，二抗選用anti-mouse或anti-rabbit抗體室溫孵育2～4 h. 將PVDF膜置于化學發(fā)光信號檢測儀上，加入預先配制好的顯影液曝光1～5 min，并保存蛋白印跡圖片.

1.4.4 ? Real-time PCR 實驗

使用Trizol試劑裂解細胞，采用氯仿抽提的方法提取細胞內總RNA，通過逆轉錄獲得cDNA，用相對應的定量引物進行實時熒光定量PCR分析，探究目的基因在RNA水平的表達情況，所用方法參照試劑盒說明書操作. Real-time PCR 反應所用引物序列如表2所示.

1.4.5 ? 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均錄入Excel文檔中保存，對照組數(shù)據(jù)和處理組數(shù)據(jù)之間顯著性差異分析采用學生雙尾t值分析方法. 用*P<0.05、 **P<0.01和***P<0.001來表示顯著性差異程度，其中P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義. 數(shù)據(jù)以means ± SD形式在圖表中顯示.

2 ? 結果與結論

2.1 ? HBV感染抑制Axin的表達和促進PD-L1的

表達

Axin在WNT信號通路中起重要的調控作用[11]，為了檢測Axin在HBV調節(jié)抗病毒免疫過程中的作用，本文檢測了HLCZ01細胞和HBV感染的HLCZ01細胞內Axin和PD-L1的表達，以探討Axin在HBV感染過程中的潛在作用. 利用實時熒光定量（Real-time PCR）方法，以MOI為20的HBV感染HLCZ01細胞45 d，提取細胞總RNA和細胞總蛋白. 利用Real-time PCR方法，以未被HBV感染的HLCZ01細胞為對照，檢測細胞內Axin和PD-L1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)HBV感染后不影響Axin和PD-L1的轉錄水平（圖1（a））. 利用Western Blot方法，檢測細胞內Axin和PD-L1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)HBV感染后抑制Axin蛋白的表達但促進PD-L1蛋白的表達（圖1（b））. 為進一步驗證這一實驗結果，在Huh7細胞中轉染表達HBV的1.3倍復制子的質粒，24 h以后提取細胞總RNA和細胞總蛋白. 利用Real-time PCR方法，檢測細胞內Axin和PD-L1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)HBV的1.3倍復制子抑制Axin的轉錄但不影響PD-L1的轉錄（圖1（c））. 借助Western Blot方法，發(fā)現(xiàn)轉染了HBV的1.3倍復制子質粒的Huh7細胞內的Axin蛋白水平明顯下調，而PD-L1的蛋白水平明顯上調（圖1（d））. 在Huh7細胞中轉染質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-HBx，48 h后收取細胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測細胞內Axin和PD-L1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)轉染了HBx質粒的Huh7細胞內Axin的蛋白水平下降，而PD-L1的蛋白水平升高（圖1（e））. 基于上述實驗結果，推測HBV導致Axin和PD-L1蛋白水平發(fā)生變化可能是通過HBx實現(xiàn)的. 此外，以MOI為20的HBV感染HLCZ01細胞45 d，然后轉染質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg或2 μg），48 h后收取細胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測細胞內Axin過表達情況和PD-L1蛋白水平，研究發(fā)現(xiàn)在

HBV感染的HLCZ01細胞內過表達Axin質粒，能夠逆轉HBV感染引起的PD-L1蛋白水平降低現(xiàn)象（圖1（f））. 由圖1可知，在HBV感染肝細胞內，Axin蛋白水平與PDL1蛋白水平呈負相關性.

2.2 ? Axin通過泛素化蛋白酶體途徑降解PD-L1

蛋白

為了進一步明確Axin與PD-L1之間的關系，在Huh7細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin，48 h后收取細胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測細胞內Axin和PD-L1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin可降低細胞內PD-L1蛋白水平（圖2（a））. 在Huh7和HEK293T細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin，48 h后收取細胞總RNA，利用Real-time PCR方法，檢測細胞內Axin和PD-L1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)在Huh7和293T細胞中過表達Axin對PD-L1的轉錄水平并無明顯影響（圖2（b））. 利用從湖南省腫瘤醫(yī)院收集48例肝癌病人癌旁組織樣本，提取組織總RNA，利用Real-time PCR方法，檢測組織內Axin和PD-L1的mRNA水平，并通過SPSS軟件分析Axin與PD-L1之間的相關性，發(fā)現(xiàn)它們的mRNA并無相關性（圖2（c））. 在Huh7細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin，48 h后加入放線菌酮素（100 μg/mL CHX終濃度），15 min和30 min后分別收取細胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測細胞內Axin過表達情況和PD-L1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin對PD-L1的翻譯水平?jīng)]有影響（圖2（d））. 最后，對其翻譯后修飾水平進行探究. 在Huh7細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin，48 h后分別加溶酶體降解途徑抑制劑（NH4Cl）[12]和蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h后收取細胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測細胞內Axin過表達情況和PD-L1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin可能通過影響PD-L1的蛋白酶體降解發(fā)揮作用（圖2（e））. 另外，在HEK293T細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin和pCDNA3.1a-PD-L1，48 h后加蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h后收取細胞總蛋白，以V5抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測細胞內PD-L1的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)Axin能促進PD-L1的泛素化（圖2（f）（g））. 在Huh7細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg或者2 μg）48 h后，在收取蛋白前6 h，加入蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132）培養(yǎng)細胞，收取的細胞總蛋白以PD-L1抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測細胞內PD-L1的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)Axin對PD-L1的泛素化呈劑量依賴性. 基于上述實驗結果，認為Axin可能通過蛋白酶體途徑降解PD-L1蛋白.

2.3 ? Axin通過影響E3連接酶SPOP的表達進而調

控PD-L1的蛋白酶體降解

蛋白與蛋白質之間的相互作用可能是通過直接或間接方式進行的. 為明確Axin對PD-L1蛋白的調控方式，首先，在HEK293T細胞中共轉染帶Flag標簽的Axin和帶V5標簽的PD-L1，通過免疫共沉淀實驗分析，發(fā)現(xiàn)Axin與PD-L1不存在直接相互作用（圖3（a））. 間接調節(jié)PD-L1的泛素化作用可能通過兩種方式，一種是調節(jié)其去泛素化酶的表達，另外一種是調節(jié)其泛素化酶的表達. NF-kb信號通路活化后，可增強PD-L1去泛素化酶的表達[13]. 將質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin轉染至Huh7細胞，48 h后分別收取細胞總蛋白，利用Western Blot和實時熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)Axin對NF-kb信號通路的活化無作用（圖3（b））. 有文獻報道E3連接酶Cbl和SPOP可泛素化降解PD-L1[14-18]. 將質粒p3 × Flag-CMV-vector或p3 × Flag-CMV-Axin轉染至Huh7細胞，48 h后收取細胞總RNA，利用Real-time PCR方法，檢測Axin對PD-L1的E3連接酶Cbl和SPOP的mRNA水平的影響，發(fā)現(xiàn)Axin對這兩種E3連接酶的mRNA水平并無影響（圖3（c））. 另外，將質粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin （1 μg或者2 μg）和pCDNA3.1a-Cbl或者pCDNA3.1a-SPOP轉染至HEK293T細胞，48 h后收取細胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測Axin對Cbl和SPOP蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)Axin可增強SPOP的蛋白表達（圖3（d））. 有文獻報道PD-L1主要通過K48位和K63位進行泛素化降解[19-21]，將質粒p3 × Flag-CMV-vector或p3 × Flag-CMV-Axin和pCDNA3.1a-PD-L1和野生型、K48或者K63的HA質粒轉染至HEK293T細胞，以V5抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測其對PD-L1蛋白泛素化的影響，發(fā)現(xiàn)Axin促進K48依賴的PD-L1泛素化降解（圖3（e））.

綜上所述，本文認為HBV可能通過其HBx下調Axin蛋白水平，降低PD-L1的E3連接酶SPOP蛋白水平，進而抑制K48依賴的PD-L1泛素化降解，導致HBV感染肝細胞內PD-L1蛋白含量增加（圖3（f））.

3 ? 討 ? 論

在HBV誘導的肝細胞癌中，癌組織中的Axin蛋白水平明顯低于其鄰近組織，但HBV下調Axin蛋白表達的機制尚不明確. 本文對HBV抑制Axin蛋白表達的機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)HBx可能參與了HBV對Axin蛋白水平的下調作用. 文獻[22-24]研究表明，在乙型肝炎病毒相關性肝癌組織中，CD8+T細胞功能異常且耗竭，其特征是PD-1高表達，干擾素-γ和腫瘤壞死因子分泌減少，但HBV感染誘導細胞內PD-L1表達的機制仍不清楚. 本文研究發(fā)現(xiàn)在HBV感染的肝細胞內，Axin蛋白表達明顯下調而PD-L1蛋白表達顯著增加. 通過相關細胞實驗和臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，Axin不能調節(jié)WNT信號通路下游轉錄因子的表達進而影響PD-L1的轉錄水平. 另外，一個蛋白影響另外一個蛋白的表達，也有可能是調節(jié)它翻譯后的降解水平來實現(xiàn)的. 通過添加相關抑制劑，發(fā)現(xiàn)Axin通過影響PD-L1的蛋白酶體降解途徑，降低病毒感染細胞內PD-L1水平. 進一步研究發(fā)現(xiàn)Axin可能通過影響PD-L1的E3連接酶SPOP的表達，進而發(fā)揮其促進PD-L1泛素化降解作用，但Axin影響SPOP表達的具體機制仍有待進一步研究. 另外，本研究只選擇了與PD-L1相關的兩種E3連接酶進行了研究，Axin是否對作用于PD-L1的其他E3連接酶有影響還有待進一步探討.

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收稿日期：2020-05-03

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81730064，81571985），National Natural Science Foundation of China（81730064，81571985）;國家科技重大專項 （2017ZX10202201），National Science and Technology Major Project（2017ZX10202201）

作者簡介：朱海珍（1969—），男，湖北襄陽人，湖南大學教授，博士

通信聯(lián)系人，E-mail：zhuhaizhen69@yahoo.com