3種杉木種子活力測定方法比較

徐振飛，過晟鵬，錢 旺，包苗清，林二培，黃華宏，童再康

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

種子活力是指種子具有的發芽潛力、生長潛力和生產潛力，是檢驗種子質量優劣的最可靠指標[1?2]。高活力的種子抗逆性強，具有實現高產量和優品質的潛在能力[3]。測定種子活力是農林業生產中不可缺少的步驟。目前，種子活力的測定方法主要有直接法和間接法2類。直接法指在實驗室模擬一定條件直接測定萌發率，如低溫發芽測定[4]和冷凍測定[5]；間接法通過測定某些與種子活力相關的生理生化指標間接評價種子活力的方法，比較常用的方法如四氮唑法(TTC)測定、電導率測定[6]、加速老化測定[7]等。不同物種的最適種子活力測定方法也不相同。POONGUZHALI等[8]發現最能正確反映黑吉豆Vignamungo種子活力的方法是加速老化法；電導率法評價紫花苜蓿Medicagosativa種子活力最為敏感[9]；而通過記錄平均胚根突出時間是測定燕麥Avenasativa種子活力高低的重要指標[10]。一般來講，直接法測定種子活力最準確，但較為耗費時間，難以大規模進行。因此多采用電導率法和TTC法等間接法測定種子活力。TTC法測定種子活力具有方便快速、結果重復性好等優點，主要用于農作物種子活力的測定[11]。電導率法根據細胞膜的完整性來評價種子活力大小，但精度受到標準參考物、溫度、水質等因素的影響較大[12]。紫外分光光度計法(UVS)由電導率法改進而來，通過測定種子浸出液的紫外吸光值，來判定浸出液中氨基酸等有機物的相對含量間接推斷種子活力。魯黎明等[13]利用UVS法測定煙草Nicotianatabacum種子活力時發現：UVS法測定種子活力簡便快捷，準確度較高。杉木Cunninghamia lanceolata是中國南方地區的優良速生用材樹種，生長快、材質較好，在中國商品材生產中占有重要地位。杉木種子活力的測定與評價是杉木良種培育、種苗生產和人工林營建的重要環節，但由于杉木種子細小、種皮堅硬，胚小易碎等，一般的種子測量方法并不能快速有效檢測。本研究以標準發芽試驗為參照，比較了TTC法和UVS法測定杉木種子活力的準確性和便捷性，旨在建立一種快速方便且較為準確的種子活力檢測方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2017年10月底至11月初，分別收集普通杉木(普杉)ZLP-1、速生型杉木(速杉)ZLS-9、龍15×閩33雙系雜交(雜杉)種子，其中普杉種子和速杉種子采自浙江農林大學林木種質資源圃，雜杉種子由浙江省開化縣林場提供。另于2018年11月初在浙江農林大學林木種質資源圃中采集優良無性系速1、新6和紅47的半同胞種子用于測定方法驗證。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 采集健康成熟球果，于陰涼通風處晾干；將種子從球果抖出，挑選健康飽滿種子裝入玻璃廣口瓶，密封后置于4 ℃冰箱保存，約6個月后用于種子活力測定。

1.2.2 標準發芽法 取3個品種杉木種子各150粒，體積分數為10%的安替福明滅菌15 min，無菌水清洗3次，無菌水中25 ℃浸泡24 h。取無菌培養皿，鋪上無菌濾紙，并用無菌水濕潤；將浸泡后的種子鋪于濾紙上，置于25 ℃光照培養箱中萌發。各樣品重復3次，每5 d 觀察統計發芽情況，15 d后統計萌發種子數，計算平均萌發率(%)。

1.2.3 TTC法 取3個品種杉木種子各150粒，按1.2.2滅菌浸泡后剝去種皮，切下種胚，加質量分數為0.1%的TTC溶液10 mL，置于35 ℃恒溫箱中染色120 min。吸去多余TTC液，清水沖洗1～2次，觀察并記錄被染色的種胚數。胚染成紅色的為具有活力的種子，計算染色百分率(%)。重復3次。

1.2.4 UVS 取3個品種杉木種子各150粒，蒸餾水清洗2次，超純水清洗1次，濾紙吸干后放入50 mL離心管中，用20 mL超純水在25 ℃下浸泡，于4、8、12、24 h后測定種子浸出液吸光度D(260)。重復3次。以D(260)為x，種子真實萌發率為y，利用Excel軟件進行線性回歸分析，建立不同時間浸出液與萌發率間的回歸方程，通過擬合系數(R2)選定用于種子活力預測的回歸方程。

1.2.5 數據處理 采用Excel及SPSS進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 真實萌發率

由表1發現：相同萌發環境下，3個品種杉木種子萌發率差異顯著(P＜0.05)。雜杉種子萌發初期萌發率較小，普杉和速杉種子在萌發初期(5 d)就表現出很高的發芽勢，均在萌發15 d時趨于穩定。統計萌發15 d 時的萌發率發現：速杉種子萌發率最高(44.88%)，普杉較低(41.11%)，雜杉最低，僅為37.33%；總體上萌發率變異系數較小，均略大于5%。

2.2 TTC 染色法

如表2可知：不同杉木種子的胚染色率存在差異，其中速杉最高(49.78%)，雜杉略低(42.22%)，普杉最低(38.89%)；變異系數波動較大。

表 1 不同杉木種子真實萌發率Table 1 Real germination rate of different C.lanceolata seeds

表 2 不同杉木種子胚 TTC 染色率Table 2 TTC staining rate of different C.lanceolata seed embryos

2.3 UVS 法

由圖1可知：隨著浸泡時間延長，同一種子浸出液吸光度[D(260)]呈現逐漸增大的趨勢；相同浸泡時長下，不同種子浸出液吸光度[D(260)]不同，3種種子間存在顯著差異。速杉種子浸出液紫外吸光值最小，說明萌發率最高，雜杉紫外吸光值最大，說明種子萌發率最低，與實際萌發率一致。對不同浸泡時間下吸光度[D(260)]與真實萌發率做線性回歸分析，得到回歸方程如下：① 4 h浸泡，y=?0.566 6x+0.449 3(R2=0.953)；② 8 h浸 泡，y=?0.309 7x+0.440 2(R2=0.899)；③ 12 h浸泡，y=?0.506 7x+0.458 8(R2=0.902)；④ 24 h浸泡，y=?0.145 7x+0.444 6(R2=0.689)。由回歸方程可看出4 h種子浸出液的紫外吸光度與萌發率之間擬合系數最高(0.953)，說明在本研究條件下，杉木種子浸泡4 h后的浸出液紫外吸光值能夠較好地反映杉木種子的活力。利用該回歸方程計算3個品種種子的萌發率(表3)，發現速杉種子萌發率為44.94%，普杉為41.00%，雜杉為37.39%；且其變異系數均約為5%。

圖 1 不同浸泡時間下杉木種子浸出液吸光度Figure 1 Absorbance of leaching solution of different C.lanceolata seeds at different soaking times

表 3 浸泡 4 h 后杉木種子吸光度 [D(260)]所對應的萌發率波動Table 3 Fluctuation range of germination rate corresponding to obsorbance[D(260)] of different C.lanceolata seeds soaked for 4 h

2.4 標準發芽法、TTC 法和 UVS 法的比較

由表4可知：標準發芽法步驟簡單，但耗時最長；TTC染色法需將種胚剝出染色，操作最為繁瑣，且較為耗時；UVS法操作簡單，耗時也最短。比較3種方法測定的萌發率(圖2)，TTC法測得的種子萌發率與實際萌發率間存在顯著差異(P＜0.05)，UVS法測定的種子活力與實際萌發率沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.5 UVS 法驗證

為了進一步驗證UVS法的穩定性，隨機選取速1、新6和紅47共3個杉木無性系，于2018年11月采集其半同胞種子進行UVS法種子活力測定，同時也采用標準發芽法和TTC法測定進行比較。活力測定方法按方法1.2.2，1.2.3和1.2.4進行。結果如表5所示：UVS法測定的結果與標準發芽法較為一致，沒有顯著差異，而TTC法測得的萌發率與其他2種方法差異顯著，說明UVS法所測得的萌發率可靠程度較高，也比較穩定，是杉木種子活力測定的較好方法。

表 4 3 種方法測定種子活力步驟與耗時比較Table 4 Comparison of three methods for determining seed vigor and time-consuming

3 討論

種子活力可以通過標準發芽法、加速老化法、TTC染色法和電導率法等多種方法進行評價，但由于受到物種、基因型和環境等因素的影響，目前并沒有通用的種子活力測定方法[14?15]。因此，針對特定植物進行種子活力測定方法的比較，對于建立適用于特定植物種子活力測定具有重要意義。

作為一種公認的種子活力測定標準方法[16]，TTC法可以根據種子的種屬、狀態等調整染色時間以達到最佳活力檢測效果[17?19]。本研究發現：由于杉木種子種皮較厚，用TTC法測定活力時需從種子中將胚剝離后再進行染色；此過程不僅費時費力，剝胚時還會造成損傷。同時由于不同種子胚的染色效果存在差異，易造成假陽性，導致活力測定結果與實際萌發率偏差較大。UVS法測定時間短、通量高、所需樣本量少，可以有效提高檢測效率，是近年來使用較多的測定種子活力的方法。邊子星等[20]在利用該方法測定瀕危華石斛Dendrobiumsinense種子活力時發現：浸泡4 h的種子浸出液吸光值與發芽率相關性較高，通過擬合回歸方程可快速預測華石斛的種子活力。岳媛[21]比較了5種杜鵑Rhododendron種子活力測定方法發現，UVS法(種子浸泡8 h)能較準確地反映出田間出苗的情況，變異系數相對較小，試驗結果較穩定，可以作為杜鵑花屬植物種子活力測定的方法。本研究首次采用UVS法對杉木種子活力進行了測定，結果發現種子浸泡4 h后，種子浸出液吸光度[D(260)]與種子活力間有較高相關性(R2=0.953)，通過預測回歸方程可以較好地擬合杉木種子活力。在實際操作中，受試種子往往不同批次、不同年份，因而萌發率會有較大波動，因此應分別計算不同批次種子浸出液吸光值與真實萌發率的相關性，從而避免較大的誤差。總體上來講，這種方法簡便快速，準確性高，有利于提高測定效率。

綜合上述實驗結果，本研究認為TTC法在測定杉木種子活力時，檢測準確率與速度上均較差；UVS法可快速檢測杉木種子活力，且操作簡便，尤其對于檢測大量不同杉木種子的活力具有更高效率。

圖 2 3種方法測得萌發率比較Figure 2 Comparison of germination rates measured by three methods

表 5 3 種測定方法的穩定性比較Table 5 Comparison of the stability of the three methods