響應面法優化杭白菊揮發油超臨界CO2萃取工藝

孟繁欽 李彥偉 孟令鍇 趙玉佳

(1.牡丹江醫學院藥學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

杭白菊(chrysanthemum morifolium)為菊科植物菊的干燥頭狀花絮，性微寒，味苦、甘，具有重要的藥用價值[1]。作為杭白菊主要藥理活性成分的揮發油，其組成包括單萜、三萜、倍半萜及其簡單含氧衍生物，具有抗菌、抗炎、鎮痙、解熱和抗腫瘤等作用[2-4]。超臨界CO2萃取技術是通過控制壓力和溫度使CO2處于超臨界狀態，使其與欲分離的物質接觸進行萃取，之后使超臨界流體恢復為普通氣體狀態，目標物則完全或基本析出，從而達到分離提純的目的。文章采用Box-Behnken響應面法，以杭白菊揮發油萃取率為響應指標，研究萃取壓力、萃取溫度及萃取時間三個影響因素的交互作用，優選超臨界CO2萃取杭白菊揮發油的最佳工藝。

1 實驗

1.1 材料與儀器

杭白菊，安國市祁澳中藥飲片有限公司；CO2氣體(純度≥99.0%)，牡丹江市金瑞氣體有限公司。HA220-50-06型超臨界萃取裝置；AF-20S型中藥粉碎機，溫嶺市奧力中藥機械有限公司。

1.2 方法

(1)超臨界CO2萃取杭白菊揮發油。稱量50g過100目篩的杭白菊粉末裝入料筒后，將其置于1L萃取釜中密封。待CO2液化并且萃取溫度和萃取壓力至設定值后，開始循環萃取，達到萃取時間，收集分離釜內的杭白菊揮發油，精確稱量其質量并計算萃取率。杭白菊揮發油萃取率計算公式(1)：

(2)杭白菊揮發油萃取工藝單因素實驗。根據經驗及相關文獻，在固定分離壓力5MPa，分離溫度40℃的條件下，分別考察不同萃取壓力(10、20、30、40MPa)、萃取溫度(30、40、50、60℃)及萃取時間(30、60、120、180min)對萃取率的變化影響。

(3)杭白菊揮發油萃取工藝響應面實驗。依據單因素實驗結果，以杭白菊揮發油萃取率(Y)為響應值，采用 Design-Expert 11軟件的Box-Behnken實驗設計原理設定萃取壓力(A)、萃取溫度(B)及萃取時間(C)三個自變量的因素水平，見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

(4)驗證實驗。結合超臨界萃取設備操作實際情況的，對最佳工藝條件進行整定。在整定的最優工藝條件下，進行萃取杭白菊揮發油，平行實驗3次，得出萃取率平均值。通過比較預測值和實驗值驗證模型的可靠性，確定最終優化工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

(1)不同萃取壓力對萃取率的影響。在固定萃取溫度為40℃、萃取時間60min的操作條件下，考察了杭白菊揮發油萃取率受不同萃取壓力的影響。在萃取壓力升高的過程中，杭白菊揮發油萃取率呈現先增大后減小的變化趨勢，當萃取壓力上升到20MPa時萃取率達最大值。

(2)不同萃取溫度對萃取率的影響。在固定萃取壓力為20MPa、萃取時間60min的操作條件下，考察了不同萃取溫度對杭白菊揮發油萃取率的影響。在萃取溫度升高的過程中，杭白菊揮發油萃取率呈現先增大后減小的變化趨勢，當萃取溫度增大為50℃時萃取率達最大值。

(3)不同萃取時間對萃取率的影響。在固定萃取壓力為20MPa、萃取溫度為40℃的操作條件下，考察了杭白菊揮發油萃取率受不同萃取時間的影響。在萃取時間不斷延長的過程中，杭白菊揮發油萃取率在萃取時間達到120min前呈現不斷增大的趨勢，時間繼續延長后萃取率基本不變。

2.2 杭白菊揮發油萃取工藝響應面實驗結果

根據Box-Behnken模型實驗法設計的17組實驗，各組實驗情況見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及實驗結果

對表2中的實驗數據借助Design-Expert 11軟件進行多元回歸分析，建立二次響應面回歸模型，得到以杭白菊揮發油萃取率(Y)為因變量，萃取壓力(A)、萃取溫度(B)和萃取時間(C)為自變量的回歸方程，對該模型進行方差分析，結果見表3，得到二次多項回歸方程：Y=4.24+0.2694A+0.1071B-0.1473C+0.0649A B+0.1272AC+0.2305BC-0.4606A2-0.1402B2-0.3434C2。

由響應面實驗回歸方差分析結果可知，本研究回歸模型F=82.63，P＜0.0001，表明模型高度顯著。實驗所選模型的相關系數R2=09907，實驗模型的校正相關系數，說明實驗的結果有97.87%受實驗因素的影響。杭白菊揮發油得率回歸模型能夠代表杭白菊揮發油實際萃取得率。對模型進行回歸方程系數顯著性檢驗可知，A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2對杭白菊揮發油萃取率影響顯著(P＜0.05)。杭白菊揮發油萃取率受各個因素的影響不是單純的線性關系，從表3可知，A＞C＞B，對其萃取工藝影響因素從大到小排序為萃取壓力＞萃取時間＞萃取溫度。

表3 響應面實驗回歸方差分析表

2.3 響應面分析結果

采用Design-Expert 11軟件對萃取壓力、萃取溫度、萃取時間3因素間的交互作用進行響應面法分析，依據回歸模型繪制出以杭白菊揮發油萃取率為響應值的三維曲面圖，結果見圖1～3。依據圖中三維響應曲面的形狀，對影響杭白菊揮發油萃取率的任意兩種影響因素的交互效應進行分析與評價。影響因素交互效應的強弱可根據等高線的形狀進行判斷，形狀若呈橢圓形表示因素交互作用顯著，若呈圓形則與之相反[5]。從圖1～3中可以看出各因素間的交互作用顯著，圖1顯示，當固定萃取時間為120min時，萃取壓力從15MPa增大到25MPa，萃取溫度從45℃增大到55℃的過程中，杭白菊揮發油萃取率呈現出先升高后降低的趨勢；圖2顯示，當固定萃取溫度為50℃時，隨著萃取壓力(15MPa＜P＜25MPa)與萃取時間(90min＜T＜150min)的增大，杭白菊揮發油萃取率呈現出先升高后降低的趨勢；圖3顯示，當固定萃取壓力為20MPa時，隨著萃取溫度(45℃＜t＜55℃)與萃取時間(90min＜T＜150min)的增大，杭白菊揮發油萃取率呈現出先升高后降低的趨勢。由各三維響應曲面圖可知，響應值存在最大值，即萃取率最大值點。通過響應面優化，杭白菊揮發油超臨界CO2萃取最佳工藝條件為：萃取壓力21.77MPa、萃取溫度52.41℃、萃取時間120.18min，該條件下杭白菊揮發油萃取率為4.308%。

圖1 萃取壓力-萃取溫度的響應值三維曲面圖

圖2 萃取壓力-萃取時間的的響應值三維曲面圖

圖3 萃取溫度-萃取時間的的響應值三維曲面圖

2.4 最優萃取工藝確定與驗證

根據響應面優化結果結合設備操作實際情況的可行性，將杭白菊揮發油超臨界CO2萃取最佳工藝條件選定為：萃取壓力22MPa、萃取溫度52℃、萃取時間120min。按此條件進行3次平行實驗驗證，杭白菊揮發油平均萃取率為4.293%，理論值與實際值之間的相對誤差為3.41%，差異不顯著，說明該方法與實際情況擬合良好。

3 結語

本研究以杭白菊揮發油萃取率為響應指標，運用響應面法中Box-Behnken模式設計，對超臨界CO2萃取杭白菊揮發油工藝中的萃取壓力、萃取溫度及萃取時間三個影響因素進行實驗分析，優選出最佳萃取工藝，為杭白菊資源充分利用提供實驗依據，具有一定實用和推廣價值。