茶樹籽蛋白質微波輔助酶解制備多肽的研究

鄭德勇 陳成聰 顏陽蕾 張潔婷 葉乃興

(福建農林大學材料工程學院1，福州 350002)(國家茶葉質量安全工程技術研究中心2，泉州 350000)(福建農林大學園藝學院；茶學福建省高校重點實驗室3，福州 350002)

中國是茶(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.)的原產地。種植茶樹主要為生產茶葉，其副產物茶樹籽的產量因品種、樹齡、栽培技術等因素而有很大差異[1,2]。據《2017中國茶業年鑒》，2016年全國18個產茶省份茶園面積為290.2萬hm2、開采茶園面積220.4萬hm2，茶樹籽產量十分可觀。茶與油茶(CamelliaoleiferaAbel.)同是山茶屬(CamelliaL.)的植物，油茶籽油是富含油酸、角鯊烯等功能成分的特種食用木本植物油，我國已有油茶林面積450 萬hm2、年產油茶籽油約60萬t；茶樹籽資源的開發利用剛剛開始，研究表明，不同品種茶樹籽含油脂17.77%～38.39%[3,4]，茶樹籽油是富含油酸、亞油酸、亞麻酸和二十二碳六烯酸(DHA)的高品質油脂[5]。目前雖有茶樹籽油產品面市[6]，但約占茶樹籽質量80%的提取殘渣未得到有效利用，使茶樹籽資源的價值不能充分展現。

生物活性肽大都具有對人體有益的生物學特性，以及易吸收、生物利用度高的優點，是極具發展前景的功能因子[7-10]。有關油茶籽粕提取多肽及其功能活性的研究大量見諸文獻[11-18]，茶樹籽粕的開發利用也受到關注，學者深入研究了茶樹籽淀粉[19-21]、蛋白質[22-24]的提取工藝和酶解產物的抗氧化能力等[25,26]。然而，植物體內游離的多肽物質通常含量很低，目前較為有效的途徑是提取蛋白質再經酶解實現批量制備，但酶解時間通常須達數小時，生產效率較低，利用微波輔助酶解技術，可將蛋白質酶解時間縮短至15 min以內[27-30]。以微波為加熱源和促酶手段，研究茶樹籽蛋白質酶解制備多肽工藝，可為茶樹籽粕的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹籽采集于福建農林大學實驗茶園，風干備用。氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、三氟乙酸和茚三酮均為國藥集團的AR試劑，胃蛋白酶、絡蛋白磷酸肽(CPP)、牛血清蛋白(BAS)為生物試劑。

1.2 茶樹籽蛋白質與多肽的制備方法

1.2.1 茶樹籽蛋白質的提取

參考陸晨等[31]方法，并改良部分操作。取200 g茶樹籽仁破碎，用2 000 mL正己烷分3次浸漬、提取油脂，殘渣蒸發溶劑、晾干，得脫脂茶樹籽粕，用于茶樹籽蛋白質提取。取100 g 脫脂茶樹籽粕于2 000 mL燒杯中，加入1 000 mL蒸餾水室溫下浸漬6 h，開啟攪拌，用10% NaOH溶液調節pH至10.0，在45 ℃水浴中處理80 min，每隔20 min測pH值、并調節至10.0。靜置30 min，傾出浸提液，5 000 r/min離心15 min，棄沉淀物；取上清液調節用10% HCl溶液調pH至4.3，在45 ℃水浴中處理80 min，5 000 r/min離心15 min，棄上清液。取出沉淀物，加入蒸餾水洗滌、離心，重復操作4次至溶液呈中性，得到沉淀物。沉淀物冷凍、在冷凍干燥機干燥，得到茶樹籽粗蛋白粉。

1.2.2 微波酶解法制備茶樹籽多肽

取0.6 g茶樹籽粗蛋白粉于100 mL燒瓶中，加入20 mL蒸餾水、攪拌，配制30.0 g/L的茶樹籽粗蛋白溶液，加熱到 90 ℃、并保持20 min后冷卻至室溫，備用。按試驗設計的條件，用10% HCl溶液調pH，將燒瓶放入超聲-微波協同萃取儀中進行處理，微波功率為700 W，酶解結束后迅速加熱到90 ℃、保持5 min滅酶，再冷卻至室溫，水解液6 000 r/min離心20 min，合并上層清液，測定其茶樹籽蛋白質水解度和水解液的多肽濃度。

1.3 茶樹籽蛋白質微波酶解工藝優化試驗方案

1.3.1 微波酶解工藝的單因素試驗

采用單因素試驗考察胃蛋白酶用量、酶解溫度、酶解時間和酶解液pH值等工藝因子對茶樹籽蛋白質微波酶解產物的蛋白質水解度和水解液多肽濃度的影響。即：固定條件為蛋白酶用量6 000 u/g、酶解液pH 2.5、酶解時間6 min，酶解溫度分別設定為35、40、45、50、55 ℃；固定條件為蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度為45 ℃、酶解時間6 min，分別調節酶解液pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5；固定條件為蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度為45 ℃、酶解液pH2.5，微波酶解時間分別設定為3、6、9、12、15 min；固定條件為pH 2.5、酶解溫度45 ℃、酶解時間6 min，胃蛋白酶用量分別為3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 u/g。

1.3.2 微波酶解工藝的優化試驗

以胃蛋白酶用量、酶解溫度、酶解時間和酶解液pH值為實驗因素，選用正交表L16(44)安排工藝優化試驗(表1)。以茶樹籽蛋白質水解度和產物多肽濃度為指標，分析確定優化工藝條件。

表1 酶解工藝優化正交試驗設計表

1.4 茶樹籽蛋白質水解度和多肽濃度的測定方法

采用改進的茚三酮比色法[32]測定茶樹籽蛋白質的水解度。采用改進的三氯乙酸沉淀雙縮脲比色法[33]測定酶解產物茶樹籽多肽的濃度。

2 結果與分析

2.1 茶樹籽蛋白質微波酶解工藝單因素試驗結果分析

2.1.1 胃蛋白酶用量的影響

由圖1可知，胃蛋白酶用量對茶樹籽蛋白質水解度和產物多肽濃度具有相似的影響，其隨胃蛋白酶用量的增加逐漸提高；當胃蛋白酶用量低于6 000 u/g，隨著胃蛋白酶用量的增大，茶樹籽蛋白水解度和產物多肽濃度均呈近線性快速上升趨勢，繼續增大胃蛋白酶用量至8 000 u/g，可能由于胃蛋白酶已經達到飽和，其增加值很小。由圖1可知，6 000～8 000 u/g是較優胃蛋白酶用量工藝條件。

圖1 茶樹籽蛋白質水解度和水解液多肽濃度與胃蛋白酶用量的關系

2.1.2 微波酶解溫度的影響

由圖2可知，微波酶解溫度對茶樹籽蛋白質水解度和產物多肽濃度具有相似的影響，在35～50 ℃范圍內隨水解溫度的升高、茶樹籽蛋白水解度和產物多肽濃度的提高速率較快，并在50 ℃達到最高值；在55 ℃下微波酶解的茶樹籽蛋白質水解度和產物多肽濃度均顯著降低。這是由于胃蛋白酶對茶樹籽蛋白的水解有“最高耐受溫度”，高于此溫度時、酶的活性受到抑制，而低于這個溫度時、酶的活性隨溫度的升高而提高。

圖2 茶樹籽蛋白質水解度和水解液多肽濃度與微波酶解溫度的關系

2.1.3 微波酶解時間的影響

由圖3可知，微波酶解時間對茶樹籽蛋白質水解度和產物多肽濃度具有相似的影響，其隨酶解時間延長逐漸提高；酶解時間由3 min提高到6 min，茶樹籽蛋白水解度和產物多肽濃度提高了近1倍，但在酶解時間達到9 min之后其增長速率減少，可以考慮在酶解工藝優化中將酶解時間的中值設定在12～15 min。

圖3 茶樹籽蛋白質水解度和水解液多肽濃度與微波酶解時間的關系

2.1.4 酶解液pH的影響

由圖4可知，酶解液pH值對茶樹籽蛋白質水解度和產物多肽濃度具有相似的影響，由pH 1.5提高到pH 3.5，茶樹籽蛋白水解度和產物多肽濃度均呈上升趨勢，其中前期上升速率較大、后期速率明顯下降，并在pH 3.5達到最高值；當pH大于3.5后，茶樹籽蛋白水解度和產物多肽濃度均迅速下降，說明胃蛋白酶在茶樹籽蛋白質微波水解體系中的“最適pH”為pH 3.5。這與胃蛋白酶一般最適pH在2.0左右存在明顯差異，這可能由于酶解是一個連續變化的過程，酶解液的實際pH值也可能隨之變化；也可能由于微波處理極大加快了酶解進程，導致微波環境下胃蛋白酶對pH的敏感性(或最佳pH)發生顯著變化；還可能由于茶樹籽蛋白質的等電點為pH 3.6[22]，高于pH 4.0時其在水中的溶解度降低，阻礙酶水解進程。

圖4 茶樹籽蛋白質水解度和水解液多肽濃度與酶解液pH的關系

2.2 茶樹籽蛋白質微波酶解工藝優化正交試驗結果分析

2.2.1 茶樹籽蛋白質水解度工藝優化條件的確定

表2為茶樹籽蛋白質微波酶解工藝優化正交試驗結果。

表2 茶樹籽蛋白質微波酶解工藝優化正交試驗結果

由表3可知，影響茶樹籽蛋白質水解度的工藝因素主次順序為D>B>C>A，最優水平分別為A3、B3、C4、D3，即茶樹籽蛋白質水解度的實驗優化條件為：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間15 min、酶解液pH值3.5。

表3 茶樹籽蛋白質水解度正交試驗表

2.2.2 酶解液多肽濃度優化條件的確定

由表4可知，影響酶解液多肽濃度工藝因素的主次順序為D>B>C>A，最優水平分別為A3、B3、C4、D3，即水解液多肽濃度的實驗優化條件為：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間15 min、酶解pH值3.5。

表4 水解液多肽濃度正交實驗K值表

2.3 茶樹籽蛋白質微波酶解制備多肽最優工藝條件的確定與驗證

綜合茶樹籽蛋白質水解度和水解液多肽濃度正交實驗結果的分析，茶樹籽蛋白質微波酶解制備多肽的最優工藝條件確定為：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間15 min、酶解液pH值3.5。依最優工藝進行重復驗證實驗，并與水浴加熱酶解處理和水浴加熱4 h的結果作為對照比較(表5)。

由表5可知，在最優工藝條件下，茶樹籽蛋白質微波酶解的產物中蛋白質水解度和水解液多肽濃度分別為13.65%和13.18 g/L，均高于單因素實驗和正交實驗的最好結果，表明工藝的優化有效。表5的結果也顯示，水浴加熱酶解4 h的水解度接近微波酶解15 min的效果，說明微波酶解工藝可顯著縮短蛋白質酶解進程、提高酶解液中多肽的含量。

微波酶解是茶樹籽蛋白質分子中的肽鍵被酶的催化作用切斷、生成分子質量較小的多肽的過程，在適宜條件下，增加胃蛋白酶用量、延長酶解時間，能提高蛋白質的水解度和產物中多肽濃度。根據蛋白質水解度定義，說明在本研究的優化工藝條件下，每個茶樹籽蛋白質分子中平均有7.3個肽鍵發生了降解，產物溶液中多肽的濃度為底物蛋白質濃度(30.0 g/L)的43.93%，取得了較好的效果。在“最佳溫度”和“最佳pH值”條件下，進一步增加胃蛋白酶用量會因催化劑飽和問題而效果不顯，而延長酶解時間，原理上應該能提高蛋白質的水解度，但同時應注意到多肽也可在此條件下進一步水解為氨基酸，產物溶液的多肽濃度會在達到一個峰值后反而因降解為氨基酸而降低，過度延長酶解時間還會降解生產效率，可見，控制酶解反應時間是必要的。

3 結論

影響茶樹籽蛋白質微波輔助酶解制備多肽的蛋白質水解度和酶解液多肽濃度工藝因素的主次順序均為D>B>C>A，其最優工藝條件確定為：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間15 min、酶解液pH值3.5。在最優工藝條件下茶樹籽微波酶解產物的蛋白質水解度為13.65%、產物的多肽濃度為13.18 g/L。