不同施肥處理條件下閩楠葉片精油組分GC/MS鑒定分析

董 翔 何功秀 文仕知 劉 麗 何含杰 張黨權

(水土保持與荒漠化防治湖南省高校重點實驗室；中南林業科技大學林學院1，長沙 410004)(河南農業大學林學院2，鄭州 450002)

閩楠[Phoebebournei(Hemsl.)Yang]，俗稱楠木，樟科楠屬常綠大喬木，是中國特有珍貴用材樹種、國家二級瀕危保護植物[1]，閩楠和楨楠、紫楠并稱為業界傳統“金絲楠”的三大載體，是建筑、家具、雕刻和精密木模等的高級用材，也是優良的庭院觀賞樹種[2]。由于野生資源的掠奪式采伐利用，導致資源日趨衰竭，價值迅速提升，人工林發展較快，由于成材期長[3]，在成材期內對其各部位精油進行開發利用，可以在不影響其生長的同時提高其經濟價值。研究人員已從閩楠、楨楠等葉片精油中檢測出β-欖香烯、反式石竹烯等大量香料和藥用類物質[4]。有研究表明β-欖香烯具有抗氧化、抗衰老、抗炎、保護心血管、防治腫瘤、改善免疫功能等作用[5]，反式石竹烯可以抑制腫瘤壞死因子誘導的人軟骨細胞炎癥[6]。閩楠葉片精油產率低、品質良莠不齊成為制約閩楠精油產業發展的問題[7]。

精油是芳香植物花、葉、莖、嫩枝、樹皮等部位的次級代謝產物，可通過壓榨、蒸餾、萃取等方法獲得[8,9]。精油的產率、品質與植物的遺傳背景，生長環境和提取工藝等息息相關[10]。通過對幾種近緣植物甜蕎麥、苦蕎麥和金蕎麥進行水蒸氣蒸餾提取精油，發現苦蕎麥精油含量明顯較高[11]。采用微波輔助法提取黑藻種子揮發油，精油產率較傳統水蒸氣蒸餾法高出0.1%[12]，以粉碎-絕氧陳化-紫外線激活的方法，可以提高柑橘香精油中的含氧萜烯類含量的相對含量，提升精油品質[13]，但這些方法儀器設備昂貴、流程復雜、成本較高。有研究人員發現配合施用牛糞和NPK3-12-6并覆蓋塑料膜可以大幅提高香葉天竺葵精油的產量[14]，施營養液會影響迷迭香中精油的含量和品質[15]，表明施肥能改善精油產率和品質，且生態環境友好，成本低，易于推廣。本研究以湖南金洞林場5年生閩楠為對象，利用水蒸氣蒸餾法和GC-MS分析，研究不同施肥處理下閩楠葉片精油的產率和揮發性成分差異，探索施肥提升閩楠葉片精油含量與品質的規律，為其精油的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葉片采自湖南省永州市金洞區金洞林場5年生閩楠，每個處理設置3塊10 m×20 m的樣地，每塊樣地的坡度、坡位均相似，樣地間間隔一行樹木，每塊樣地30株樹。2018年9月1日人工除草后，將12塊樣地分為4組，分別進行環施有機肥1 kg/株、復合肥400 g/株、菌肥20 g/株和不施肥處理，施肥濃度選擇林場施肥管理常用的濃度。90 d后，采取五點取樣法隨機采集各樣地閩楠的葉片，混合，洗去葉片表面灰塵雜質，自然風干后，打粉備用。室內實驗于2018年12月8日—10日在經濟林育種與栽培國家林業和草原局重點實驗室完成。GC/MS鑒定與分析由湖南省食品質量監督檢驗研究院完成。

1.2 儀器與試劑

氣相色譜-質譜儀GC7890B-MS5975C，智能恒溫加熱套，超純水機。

無水乙醇(分析純)，去離子水，無水硫酸鈉(分析純)，1.5 mL離心管，有機肥(氮磷鉀5%，有機質45%)，復合肥(氮15%，磷15%，鉀15%)，菌肥(復合芽孢桿菌)。

1.3 精油水蒸氣蒸餾法提取

提取方法參照朱麗云等[16]、毛運芝等[17]方法并進行改進，取300 g閩楠葉片樣品粉末放入5 L蒸餾瓶中，加入2 400 mL去離子水(料液比1∶8)，采用水蒸氣蒸餾裝置100 ℃提取7 h,加裝冷凝回流裝置和收集裝置，收集裝置中水液面上方一層淡黃色油狀物，即為樣品精油，提取完畢待管壁冷卻后，用移液器將精油移至1.5 mL離心管中，4 ℃密封保存。精油產率計算方法[18]：閩楠精油產率=精油體積/閩楠葉質量×100%，取平均值即為精油產率。

1.4 精油檢測方法與條件

前處理：移液器吸取無水乙醇1 mL至1.5 mL離心管中，再吸取20 μL精油伸入乙醇液面下，將精油推入，搖勻，加入適量無水硫酸鈉，搖晃半分鐘左右，靜止3 h，8 000 r/min離心2 min，取700 μL送檢。

精油檢測：參照丁文等[19]方法對四種施肥處理的閩楠葉片精油進行GC-MS檢測，對檢測條件進行了改動和優化。

色譜分離條件：色譜柱為Agilent-HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣量1 μL，進樣口250 ℃；載氣為高純氦氣；柱溫箱升溫程序則是初始溫度50 ℃，以5 ℃/min升到130 ℃，再以2 ℃/min升到155 ℃，8 ℃/min升到180 ℃，10 ℃/min升到250 ℃；分流比20∶1。

質譜檢測條件：離子源為EI；電離能70 eV；輔助加熱區280 ℃；離子源230 ℃；四級桿150 ℃；采集模式為全掃描，質量掃描范圍35～550(m/z)；溶劑延遲3 min。

1.5 數據處理與分析

閩楠葉片精油經GC-MS檢測后，采用化合物譜庫(NIST17)進行分析，得出各峰的物質和匹配度，統計各峰匹配度大于90%的物質，并參考保留時間確定物質，繪制表格。采用色譜峰面積歸一化法，并參照卞京軍等[20]方法進行定量分析。數據與統計分析及表格繪制采用Excel 2016完成，離子流量圖及柱狀圖繪制采用Origin 9.0完成。

2 結果與分析

2.1 閩楠葉片精油產率分析

由表1可知，閩楠葉片精油產率分別為有機肥處理0.095 7%，復合肥處理0.085 0%，菌肥處理0.070 9%，不施肥處理0.076 7%。有機肥處理組的閩楠葉片精油產率最高，較不施肥處理組提高24.77%、較復合肥處理組的精油產率提高12.59%。菌肥處理組的精油產率最低，較不施肥處理組低7.56%。四種處理精油均為淡黃色油狀，其中復合肥處理組顏色最深，菌肥處理組顏色最淺，表明閩楠葉片精油中某些與顏色相關的成分的相對質量分數以復合肥處理最高，菌肥處理最低。

表1 四種施肥處理閩楠葉片精油產率及性狀

2.2 精油揮發性成分組成

經GC-MS分析得到4種施肥處理的閩楠葉片精油總離子色譜圖(圖1)，共鑒定出83種揮發性成分，相對質量分數大于1%的主要化學成分如表2所示。其中有機肥處理精油中共檢測出67種揮發性成分，主要物質有牛兒烯(14.50%)，(+)-喇叭烯(13.35%)，(-)-α-蒎烯(5.72%)，δ-杜松烯(5.58%)，β-桉葉醇(4.66%)等。復合肥處理精油中共檢測出72種物質，主要物質有(+)-喇叭烯(15.67%)，牛兒烯(12.82%)，δ-杜松烯(6.96%)，(-)-α-蒎烯(4.19%)，(+)-香橙烯(4.02%)等。菌肥處理精油中共檢測出65種揮發性成分，主要物質有牛兒烯(16.51%)，(+)-喇叭烯(12.81%)，δ-杜松烯(9.66%)，(+)-香橙烯(5.41%)，蛇麻烯(3.92%)等。不施肥處理精油中共檢測出66種揮發性成分，主要物質有牛兒烯(20.34%)，(+)-喇叭烯(16.28%)，δ-杜松烯(5.02%)，(+)-香橙烯(4.89%)，(-)-α-蒎烯(4.09%)等。

表2 四種施肥處理的閩楠葉片主要精油化學成分及相對質量分數

圖1 四種施肥處理閩楠葉片揮發性成分總離子色譜圖

2.3 4種施肥處理的閩楠葉片精油典型組分質譜圖分析

參考胡文杰等[21]、邱海燕等[22]研究，以相對含量大于5%為標準，確定閩楠葉片精油典型組分。由表2分析可得，四種施肥處理的閩楠葉片精油中相對含量大于5%的典型組分有5種，分別是：牛兒烯，(+)-喇叭烯，(-)-α-蒎烯，δ-杜松烯，(+)-香橙烯，GC-MS分析得到五種物質的質譜圖如圖2所示。五種物質的分子式均為C15H24，相對分子質量為204，與質譜圖中顯示的分子離子質荷比為204一致。

圖2 閩楠葉片精油典型組分質譜圖

2.4 4種施肥處理的閩楠葉片精油品質分析

2.4.1 揮發性成分種類的數量差異

四種施肥處理90 d后的閩楠葉片精油分離出的揮發性成分見圖3，共包括烴類47種、醇類17種、醛類8種、萘類6種，酮類3種、酯類1種、呋喃1種。其中，四種處理的葉片精油中相同成分有51種，多數為萜烯烴類和萜醇類化合物，是閩楠精油芳香氣息的主要來源，表明施肥處理不會造成閩楠葉片精油成分的種類發生大幅度的變化，但仍有一定的差異。有機肥提高了烴類、醛類、萘類物質的數量，降低了酮類和呋喃類物質的種類；復合肥提高了烴類、醇類、醛類、萘類物質的數量；而菌肥提高了醇類、萘類物質數量，降低了烴類、酮類物質數量。

圖3 4種施肥處理的揮發性成分種類的數量

2.4.2 揮發性成分種類的相對質量分數差異

4種施肥處理的揮發性成分種類及其相對質量分數(圖4)與不施肥組相比，有機肥和復合肥均可降低閩楠葉片精油中烴類物質的相對質量分數，提高醇類、醛類、萘類、酯類物質的相對質量分數；而菌肥則提高了烴類、醛類、呋喃類物質的相對質量分數，其他類均降低。有機肥處理、復合肥處理、菌肥處理和不施肥處理的含氧化合物的總相對質量分數大小分別為19.58%、19.51%、13.07%、17.52%。而精油品質優劣與含氧化合物含量密切相關，常用于提升精油品質的方法為降低精油中烴類物質含量、提高含氧化合物含量[23]。因此，有機肥與復合肥處理降低了葉片精油中烴類物質含量，提高了含氧化合物的含量；而菌肥處理則提高了烴類物質相對質量分數，降低了含氧化合物總相對質量分數。表明有機肥與復合肥處理可以提高閩楠葉片精油品質，且有機肥處理的精油品質更高，而菌肥處理會降低精油品質。

圖4 四種施肥處理的精油揮發性成分種類及相對質量分數

2.4.3 揮發性成分相對質量分數差異

由表2可以看出，與不施肥處理相比，有機肥處理提高了葉片精油中28種物質的相對質量分數，降低了48種物質的相對質量分數；復合肥處理提高了39種物質的相對質量分數，降低了27種物質的相對質量分數；菌肥處理提高了29種物質的相對質量分數，降低了44種物質的相對質量分數。每個處理組相對質量分數最高的六種揮發性成分比較如圖5所示。四種施肥處理的葉片精油中，牛兒烯和(+)-喇叭烯的相對質量分數較最高。有機肥處理的閩楠葉片中相對質量分數大于1%的共檢測出23種，(-)-α-蒎烯、β-桉葉醇和反式石竹烯比其他處理組高，比不施肥處理組分別高1.63%、1.95%、1.73%(圖5a)。復合肥處理的閩楠葉片中相對質量分數大于1%的共檢測出23種，(-)-α-古蕓烯比其他組高，比不施肥處理高0.71%(圖5b)。菌肥處理的閩楠葉片中相對質量分數大于1%的共檢測出23種，δ-杜松烯、(+)-香橙烯、蛇麻烯和大牛兒烯D均比其他處理組高(圖5c)，比不施肥處理分別高4.64%、0.52%、3.23%、0.54%。不施肥的閩楠葉片中相對質量分數大于1%的共檢測出22種，牛兒烯和(+)-喇叭烯的含量均高于其他處理組(圖5d)。因此，不同施肥處理可以用來提高或降低精油中某些成分的相對質量分數，可用于定向培育與開發利用。

圖5 4種施肥處理的揮發性成分種類及相對質量分數

3 討論

在提取工藝方面，本研究改進了朱麗云等[16,17]的水蒸氣蒸餾提取方法，調整料液比從1:6至1:8，以回流速度每秒2～3滴作為參考標準設定溫度[24]，采用5 L容量瓶，加入300 g葉片和2.4 L水進行提取，在冷凝回流管下方增加了一個定制的虹吸式連通器[25]收集裝置，解決了提取過程中料液比不適宜及加熱套溫度過高導致蒸餾瓶壁易出現焦糊狀物質的問題，避免了提取過程由于過滿，容易向上噴涌的安全隱患問題，提高了精油提取精度，減小了精油損耗，并方便觀測和收集。

針對施肥對植物精油含量及品質影響方面研究發現[26-30]，檸檬馬鞭草施用生物肥料能顯著提高精油含量，蒔蘿施用生物肥料和化肥可增加精油中香芹酮含量，互葉白千層施用微量元素硼會降低枝葉精油中1,8-桉葉素的含量，桂花施磷肥則會降低精油中的物質種類，而迷迭香精油產量和組分則不受無機肥和有機肥的影響。本研究表明，閩楠施有機肥和復合肥能明顯提高葉片精油的產率和品質，而菌肥會降低產率和品質。三種施肥處理的葉片精油中牛兒烯含量均低于不施肥組，表明了牛兒烯作為平臺中間體在施肥后被用于合成了其他活性成分，菌肥處理后可能用于合成了烴類物質。因此，通過施肥提高閩楠精油的產率和品質，調控其精油的關鍵組分產量，對提升閩楠的實際應用價值和經濟價值，具有很高的探索和應用價值。

4 結論

有機肥、復合肥、菌肥和不施肥處理90 d的閩楠葉片精油產率分別為0.095 7%、0.085 0%、0.070 9%、0.076 7%。有機肥和復合肥可以提高閩楠葉片精油的產率，而菌肥會降低葉片精油產率。

從四種施肥處理的葉片精油中分別檢測出物質67種，72種，65種，66種。精油分離出的揮發性成分共包括烴類47種、醇類17種、醛類8種、萘類6種，酮類3種、酯類1種、呋喃類1種。

四種施肥處理的葉片精油中含氧化合物的總相對含量大小分別為19.58%、19.51%、13.07%、17.52%。有機肥和復合肥可以提高閩楠葉片精油的品質，而菌肥會降低精油品質。

閩楠葉片精油典型組分為牛兒烯，(+)-喇叭烯，(-)-α-蒎烯，δ-杜松烯，(+)-香橙烯。不同施肥處理可以用于改變葉片精油中成分的種類和相對含量，也可以用于提高特定需求成分或降低有害成分的相對含量，對閩楠進行定向培育與開發利用。