放射治療相關腫瘤血管生成的研究進展

黃 皓 ，周光明，2，胡文濤，2*

（1. 蘇州大學放射醫學與防護學院，蘇州 215123；2. 放射醫學與輻射防護國家重點實驗室，蘇州 215123）

近年來，放射治療技術發展迅速［1-2］，調強放射治療（intensity-modulated radiation therapy, IMRT）、容積調強弧形治療（volumetric-modulated arc therapy, VMAT）、圖像引導放射治療（image-guided radiation therapy,IGRT）等放射線劑量輸送方式的革新和質子、重離子等高傳能線密度（linear energy transfer, LET）射線的應用大大提高了腫瘤放射治療的水平。然而，放療后腫瘤的轉移和復發仍然是局部晚期腫瘤患者死亡的主要原因。研究表明，腫瘤轉移的一個重要因素就是放療導致的腫瘤血管生成［3］。在輻射的刺激作用下，腫瘤細胞會分泌多種細胞因子，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、轉化生長因子 -β（transforming growth factor-β, TGF-β）等，其中VEGF是一種強效的促血管生成因子，能夠誘導腫瘤組織內部的血管增生，這些新生血管將氧氣和營養物質輸送給腫瘤組織，促進其增殖的同時也促進了其轉移和復發。可見，腫瘤血管生成是放療后腫瘤復發和轉移的關鍵。

1 放射治療引起的腫瘤轉移與血管生成密切相關

已經有許多臨床研究表明，輻射能夠刺激腫瘤內部血管增生，導致腫瘤細胞惡性化程度增高，進而促進腫瘤的轉移和復發。Pueyo等［4］分多次輻照人皮膚癌A431細胞系，將存活的癌細胞經皮下注射進入裸鼠體內，通過分析腫瘤生長、細胞增殖指數Ki-67、微血管密度（microvessel density, MVD）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和轉化生長因子 -α（transforming growth factor-α, TGF-α）的轉錄水平以及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的分泌水平發現，與未經處理的細胞相比，受照細胞形成的腫瘤具有更快的生長速度、更高的Ki-67指數和更加豐富的血管生成，故推測這種侵襲性表型與輻射誘導的細胞外信號相關激酶 ERK-1/2（extracellular regulated protein kinase-1/2,ERK-1/2）和蛋白激酶 B（protein kinase B, PKB 或 Akt）的激活、EGFR和TGF-α轉錄水平的增高以及VEGF分泌的增加有關。Jung等［5］發現，在電離輻射的作用下，腫瘤細胞的應力纖維和黏著斑增加，而細胞間連接減少，故推測放療后癌細胞的轉移可能涉及細胞間黏附的喪失。此外，輻射上調了細胞內p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）磷酸化水平，誘導發生了一系列與上皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相關的變化，顯著增強了細胞的運動性。由此說明，放射治療引起的EMT相關的細胞遷移在放療導致的晚期腫瘤進展中起著重要作用［6］。Koukourakis等［7］對24 例頭頸部鱗狀細胞癌（squamous cell head and neck cancer, SCHNC）患者進行了常規分割放療（總劑量為20 Gy），并在放療前后進行了原發灶活檢，應用免疫組織化學的方法評估MVD［8］和胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase, TP）的表達，結果發現，放療后存活癌組織區域的MVD顯著高于放療前，具有核TP表達的癌細胞也顯著增加，表明放療期間豐富的血管生成對SCHNC放療產生了不良影響。在另一項研究中，Koukourakis等［9］對25例接受術前放化療的Ⅱ/Ⅲ期結直腸癌患者進行了檢查，評估了其增殖指數Ki-67、血管密度（vascular density, VD）和乏氧誘導因子-1 α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）的表達水平，結果發現，放療前的高VD值與較差的無局部復發生存率（local relapse free survival, LRFS）有相關性，而增殖指數Ki-67和HIF-1α與LRFS無相關性。放療后患者的增殖指數Ki-67增高，VD值也超過治療前的水平，表示血管新生導致了較低的LRFS，這與結直腸癌患者放療的失敗密切相關。Marques等［10］研究發現，放療過程中受到低劑量照射的直腸癌患者的癌旁組織中的促腫瘤血管生成基因顯著上調，MVD顯著升高，說明放療誘導的腫瘤血管生成不容忽視。Zhu等［11］的研究也發現，放療能誘導肺癌患者腫瘤組織內的HIF-1α/VEGF通路上調，而抑制該通路可以降低放療誘導的腫瘤血管生成，表明放療誘導的肺癌血管生成涉及HIF-1α/VEGF通路的激活。

綜合上述研究結果可知，放射治療之后，殘余的腫瘤細胞具有更高的惡性程度、更強的運動性以及更豐富的血管生成，這些特征將導致腫瘤的復發和轉移，最終造成放射治療的失敗。

2 放射治療相關腫瘤血管生成的分子機制

電離輻射可以誘導多種細胞膜酪氨酸激酶受體的活化，包括紅細胞白血病病毒癌基因同源物（erythroblastic leukemia viral oncogene homolog, ErbB）家族成員和胰島素樣生長因子 -1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）等。生長因子受體（如EGFR）和IGF-1發出的信號可以通過多個下游信號分子傳遞，例如通過原癌基因Ras、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、c-Jun N 末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）、p38MAPK、Fas受體（Fas receptor,Fas-R）和腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor, TNF-R）等向半胱天冬蛋白酶原和活化B細胞的核因子-kappa輕鏈增強子（nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells, NF-κB）進行信號傳導［12］。這些由輻射誘導的下游分子有一部分可直接靶向VEGF［13］，還有一部分可以通過促進HIF-1α蛋白表達或激活HIF-1α的轉錄間接促進VEGF的表達，最終調控血管生成（圖1）。

受輻射調控的血管生成信號通路包括環氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）、一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）、EGFR、IGF-1等。這些通路能夠提供誘導血管生成的共刺激信號：1）輻射激活COX-2［14-15］，進而誘導產生前列腺素H2（prostaglandin H2, PGH2）。PGH2可作用于血栓素 A2（thromboxane A2, TXA2）直接調控血管生成，也可以通過前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）增加 HIF-1α和 VEGF 的表達水平［16］。此外，有研究數據表明，PGE2還能夠與前列腺素E2受體2亞型（prostaglandin E2 receptor subtype 2, EP2）結合，并激活環狀腺苷單磷酸（adenosine monophosphate, AMP）和 VEGF 的產生［17］；2）NOS的激活是電離輻射介導的早期信號事件［18-19］，而NO可以通過 PI3K/Akt/FRAP［20］或者 PI3K/Akt/mTOR［21］途徑誘導HIF-1α的表達［22］；3）輻射激活的EGFR通路較為復雜，它可通過多條受體介導的HIF-1α調節通路，刺激血管生成［23］，包括Ras/MEK/MAPK、Ras/MEK/ERK/MNK、PI3K/Akt/FRAP、PI3K/Akt/mTOR等激酶級聯信號通路［24］，并最終通過VEGF促進血管生成；4）輻射激活的IGF-1通路［22］也有多條途徑，包括PI3K/Akt/FRAP、PI3K/Akt/mTOR、MEK/ERK/MNK、IGF-1/MEK/MAPK等激酶級聯信號通路，最終通過HIF-1 α和VEGF發揮促血管生成的作用（圖1）。

圖1 輻射誘導血管生成的可能機制［25］Fig. 1 Potential mechanisms of radiation-induced angiogenesis［25］RAF：迅速加速的纖維肉瘤激酶；FRAP：FK506結合蛋白-12/雷帕霉素相關蛋白激酶；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；MEK：絲裂原活化蛋白激酶激酶；MNK：MAP激酶相互作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶。RAF: Rapidly accelerated fibrosarcoma kinase； FRAP: FK506-binding protein-12/rapamycin-associated protein kinase； mTOR: Mammalian target of rapamycin； MEK: Mitogen-activated protein kinase kinase；MNK: MAP kinase interacting serine/threonine kinase.

有研究表明，輻射可以通過基質細胞衍生因子 -1（stromal cell-derived factor-1, SDF-1）［26］和活性氧（reactive oxygen species, ROS）［27］來激活血管生成，前者受到HIF-1α蛋白的間接調控，而后者則要通過激活HIF-1α的轉錄來對血管生成產生影響。然而，這些研究并未探究其中具體的分子機制，具體的分子機制還有待于后續的研究。最近有學者提出，細胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）在輻射誘導的腫瘤血管生成中也發揮了重要作用。受輻照腫瘤細胞來源的EVs介導的miR-23a［28］或血管生成素樣蛋白 4（angiopoietin-like 4, ANGPTL4）［29］等分子能通過增強肺癌組織中人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）的增殖和遷移促進腫瘤組織的血管生成。

除了以上幾條信號通路以外，輻射還可對腫瘤血管系統本身產生影響。一方面，隨著腫瘤的快速生長，血液灌注不足使得腫瘤微環境變得缺氧［30］，在乏氧的條件下，低劑量照射可激活血管內皮細胞的血管內皮生長因子受體 2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2），并增強 VEGF 的表達［31-32］。另一方面，輻射還會導致血管內皮細胞的損傷，尤其是那些處于增殖期的血管，這會使得原本因為腫瘤細胞過度增殖形成的乏氧微環境的乏氧程度加重，進一步刺激腫瘤細胞中乏氧誘導因子HIF-1α的表達，從而通過靶向血管內皮生長因子VEGF來刺激血管生成。此外，輻射還可通過TGF-β對血管生成產生間接影響。輻射能夠誘導腫瘤細胞中TGF-β表達上調，而TGF-β能夠通過激活HIF-1α進而誘導VEGF的表達［33］。TGF-β還能促進腫瘤微環境（tumor microenvironment, TME）的重塑、EMT等，它是促進實體瘤轉移的關鍵因素之一［34-35］。總之，在輻照后的腫瘤微環境里，TGF-β的表達增強是出現繼發惡性腫瘤（secondary malignant neoplasm, SMN）的主要原因之一。

綜上可知，輻射通過多條分子通路刺激腫瘤組織內的血管生成，其中多數分子通路涉及HIF-1 α/VEGF的激活。在某些腫瘤中，細胞外囊泡在輻射誘導的腫瘤血管生成中也發揮了重要作用。

3 放射治療和血管生成抑制劑聯合治療方案用于腫瘤治療的臨床研究進展

腫瘤組織的生長依賴于強力擴張的脈管系統，尤其離不開輸送營養物質和氧氣的血管［36］。而任何實體腫瘤在生長到一定階段后，都會出現由于瘤體內部區域血管分布不足、血液灌注不佳所導致的乏氧區域，這樣的區域被稱為乏氧微環境。乏氧條件通過抑制輻射引起的DNA損傷的“固定”而形成輻射抗性。而抗血管生成劑可特異性靶向并抑制新生血管的生長，調節癌癥的血流和氧合作用，使得處于乏氧狀態的腫瘤組織能夠再度氧合，從而導致腫瘤組織的放射敏感性增加［37-39］。目前，多種天然或合成的血管生成抑制劑已被發現或開發，這些藥物通常分為4類：1）天然存在的血管生成抑制劑（如血管內皮抑素）；2）抗促血管生成受體的抗體（如Avastin）；3）促血管生成配體的清除劑（如DC101）；4）針對促血管生成受體的酪氨酸激酶活性的抑制劑（如SU6668）［40］。

在臨床治療方面，自從2004年美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準首個用于治療轉移性結直腸癌的血管生成抑制劑（貝伐單抗）以來，血管生成已成為癌癥治療的熱點靶標。在隨后的幾年中，許多血管生成抑制劑陸續被開發，其中包括從單克隆抗體、內源性肽、有機小分子到microRNA等多種產品［41］。

目前，這些血管生成抑制劑已被用于靶向治療各種癌癥。然而，由于耐藥性的出現，研究人員不得不開發新的血管抑制劑，并進行相應的臨床試驗。Chao等［42］開發出了一類新型的甾族化合物SR16388，旨在阻斷癌組織中的血管生成。這種先導化合物在納摩爾范圍內對雌激素受體-α（estrogen receptor alpha, ER-α）和雌激素受體 -β（estrogen receptor beta,ER-β）具有結合親和力。其體外試驗結果發現，它能夠抑制人微血管內皮細胞（human microvascular endothelial cells, HMVEC）和各種類型的人類癌細胞的增殖。3 mg/L的SR16388能使雞胚絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）中的血管密度大大降低 ；2 μmol/L的SR16388可阻止HMVEC在Matrigel中形成血管樣結構；0.5 μmol/L的SR16388對HMVEC細胞的遷移抑制率為80%。此外，SR16388還下調了非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中促血管生成轉錄因子、HIF-1α以及信號轉導和轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）的表達。這些結果表明，SR16388可有效降低體內血管化程度并抑制腫瘤生長。Matsumoto等［43］對抗血管生成劑舒尼替尼的治療效果進行了研究，結果發現：使用舒尼替尼這種多靶點酪氨酸激酶抑制劑進行抗血管生成治療后2～4 d，腫瘤氧合短暫改善，MVD降低了45%；舒尼替尼能抑制血管正常化窗口期間腫瘤氧分壓的波動程度，導致腫瘤缺氧程度減輕。這表明舒尼替尼能夠有效抑制血管生成，改善腫瘤內部區域的乏氧程度。

放療所致的腫瘤血管生成在腫瘤的復發和轉移中扮演了重要的角色，而單純的血管抑制劑療法雖然能夠在一定程度上抑制腫瘤的生長，但其耐藥性的產生、腫瘤缺氧加劇以及化療藥物的遞送阻礙等局限性導致臨床中施用血管生成抑制劑后總體生存率的改善較差［44］。針對這些問題，研究人員已在探究通過抗血管藥物聯合放射治療（radiation therapy, RT）來提高局部控制率的可能性［45-46］。一些研究結果已揭示，血管生成抑制劑與RT聯合使用產生加成效應的可能機制包括：1）直接的腫瘤抑制效應；2）通過消除無效的腫瘤血管網絡［47-48］、減少組織間液壓力、使內皮細胞輻射増敏［49］等機制改善腫瘤的氧合作用；3）對抗放療誘導的血管形成，預防或延遲腫瘤復發。Gu等［50］發現具有DNA修復作用的人嘌呤/嘧啶核酸內切酶 1（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1, APE1）同時也是一種重要的血管生成調節劑。他們研究了APE1在NSCLC放療誘導的腫瘤血管生成中的作用及其潛在機制，發現NSCLC中APE1和VEGF的表達率高，分別為77.94%和66.18%。此外，APE1的表達與VEGF和MVD顯著相關；APE1和VEGF的高表達與無病生存時間（disease-free survival, DFS）縮短顯著相關；X射線可同時誘導APE1和VEGF在A549細胞中的高表達，且呈現劑量依賴性；APE1的沉默顯著抑制了輻照誘導的內皮細胞的遷移和毛細血管樣結構的形成。這些結果表明，血管生成調節劑APE1可能在輻射誘導的血管生成中起關鍵作用，放療期間給予靶向抑制APE1的siRNA可能成為增強放療反應、有效消除轉移并提高NSCLC放療效果的有效輔助療法。Teicher等［51］最先在體內評估血管生成抑制劑與單劑量放療聯用的效果，發現聯合治療可顯著延緩腫瘤的再生長。他們以大鼠皮下膠質肉瘤為模型，用抗血管生成劑TNP-470和米諾環素對其進行治療，結果發現，5 d后，動物體內腫瘤乏氧的程度減輕，與未治療組相比，治療組因乏氧程度的減輕使得腫瘤對單劑量（10、20和30 Gy）放射治療的反應明顯增強。目前，這些發現已應用到各種臨床前腫瘤模型的研究中，并具有不同程度的療效［52-54］。

國外的一些臨床研究顯示，放療聯合血管抑制劑的療效顯著［55］。貝伐單抗作為一種VEGF抑制劑，已用于頭頸癌（head and neck cancer, HNC）的臨床試驗，其結果指出，聯合用藥之后，放療效果得到了明顯改善［56］。David等［57］報道了用貝伐單抗和厄洛替尼（EGFR阻滯劑）聯合放化療（chemoradiotherapy, CRT）治療29例局部晚期HNC患者的結果。調強放療總劑量為70 Gy左右（69.5～71.5 Gy），貝伐單抗和厄洛替尼的中位藥物劑量分別為3 905 mg和4 900 mg，聯合治療之后，存活患者完全緩解率（cure rate, CR）達到96%，3年局部區域控制率、無遠處轉移生存率、總生存率分別為85%、93%、86%。Haas等［58］采用血管抑制藥物帕唑帕尼聯合放射治療的方案對12例肢體軟組織肉瘤（extremity soft tissue sarcomas, ESTS）患者進行治療。每天給予1次帕唑帕尼（藥物劑量分為400、600和800 mg 3組），共治療6周，并于第8天開始術前放療（總劑量為50 Gy），5～7周后有10例患者接受了手術。結果顯示，10例患者中有4例病理完全緩解。還有1份病例研究報告顯示，1例腎癌患者在接受放療（10×3 Gy）聯合新輔助藥物以及帕唑帕尼后，胃和食管轉移得到完全緩解［59］。Viswanathan等［60］研究了術后放療期間聯合貝伐單抗和化療藥物的治療效果，30位子宮內膜癌（endometrial cancer, EC）患者在手術后第29～56天開始進行IMRT治療，在放療的第1、29天給予順鉑［50 mg/(m2·d)］治療，同時，在放療第1、15和29天給予貝伐單抗［5 mg/(kg·d)］治療，之后以可選擇的高劑量率（6 Gy，3次分割，60 Gy/h）或者低劑量率（25 Gy，0.8～1.2 Gy/h）的照射方式增加劑量，隨后是4個周期的卡鉑和紫杉醇（劑量為135 mg/m2）治療，最終2年總體生存率和無進展生存率分別為96.7%和79.1%。結果表明，術后化療和盆腔調強放療加用貝伐單抗治療的耐受性良好，提高了高危子宮內膜癌患者的2年總體生存率。

國內也有不少學者報道了放療聯合血管生成抑制劑的臨床研究（表1）。Chen等［61］發現在聯合索拉非尼和常規分割放療時的藥物毒副作用是可以接受的。40例肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）患者從放療開始以200 mg/次、2次/d的劑量給藥（索拉非尼），并持續至患者出現臨床或放射學進展為止，累積RT劑量為40～60 Gy（2.0～2.5 Gy/次），共33例患者完成了全部RT療程，部分病人出現2級或2級以上的手足皮膚反應、腹瀉、肝毒性等情況。最終有22例患者（55.0%）完全緩解或部分緩解，2年總體生存率和內野無進展生存率（infield progressionfree survival, IFPS）分別為32%和39%。結果表明，在聯合放療與索拉非尼協同治療時，放療與血管抑制劑的劑量還有待優化。Bao等［62］對不可切除的Ⅲ期NSCLC患者實施了內皮抑素聯合同步放化療（concurrent chemoradiotherapy, CCRT）的治療方案。患者在第1、3、5和7周接受內皮抑素［7.5 mg/(m2·d)］治療，在第8、36天分別給予2個療程的紫杉醇（65 mg/m2）和順鉑（65 mg/m2）治療，同時進行胸腔常規分割放射治療（2 Gy/次），累積劑量達60～66 Gy。在48例可評估患者中，有83%的患者處于IIIB期，65%的患者有N3期轉移。總體應答率為77%，第1、2、3年局部控制率分別為75%、67%和51%，無進展生存率分別為48%、27%和16%，總體生存率分別為81%、50%和30%。結果表明，內皮抑素與同步放化療CCRT聯合用于局部晚期NSCLC顯示出了可觀的生存率和局部控制率。Zhai等［63］為研究厄洛替尼和放療同時作為不耐受放化療的食管癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）患者的替代治療方式的安全性和有效性，共招募了18例局部晚期食管鱗狀細胞癌患者。所有患者均接受IMRT，總劑量為60 Gy（2 Gy/次），放療期間同時給予厄洛替尼150 mg/d，共60 d。治療期間出現5例（27.8%）3級食管炎、2例（11.1%）3級皮疹、1例2級放射性肺炎和1例5級放射性肺炎，沒有觀察到3/4級肝功能受損或血液學毒性。放療后1個月，有2例（11.1%）患者完全緩解，11例（61.1%）患者部分緩解，5例（27.8%）患者病情穩定。最終2年總生存率、無進展生存率和局部區域無復發生存率分別為44.4%、38.9%和66.7%。研究結果表明，對于不能耐受放化療的食管鱗狀細胞癌患者，給予厄洛替尼聯合放療是可以耐受且有效的。

表1 血管抑制劑聯合放療案例一覽Tab. 1 Case summary of anti-angiogenetic drugs and radiotherapy

以上臨床研究表明，血管生成抑制劑聯合放射治療的局部控制率和總體生存率相對于單純放療有明顯提高，具有降低對正常組織的放射性損傷、提高患者毒性耐受能力等特點，對于改善患者預后，減少腫瘤復發有明顯的效果。可以預見，抗血管生成這種輔助療法在未來的腫瘤放療中將扮演越來越重要的角色。

4 總結與展望

血管生成對腫瘤放射治療效果的影響不言而喻。近年來，已有學者提出血管生成可以作為腫瘤對放射治療反應的預測因子［65-66］。而抗血管生成藥物的出現，不僅為腫瘤治療提供了新的思路，也極大地改善了放射治療的效果［67］。此外，不斷發展的醫學影像學技術如高分辨率計算機斷層掃描（high resolution computed tomography, HRCT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）等為血管生成情況的監控提供了便利［68-69］。

盡管目前已有一些臨床研究基礎和對初步療效的肯定，但對于放射治療聯合血管生成抑制劑的療效還有待優化，患者耐受性等問題還有待解決，其毒副作用尚有待降低，具體的治療效果可能會受到年齡、性別、人種、腫瘤類型、患者身體條件、腫瘤的惡性程度等多方面因素的影響，這些實際存在的問題都對這種新的聯合治療方案提出了挑戰。通過分析放療導致腫瘤血管生成的分子機制可知，輻射誘導的腫瘤血管生成是包含了輻射應答通路在內的多信號通路協同作用的結果。因此，新的血管生成抑制靶點的發現和多靶點藥物的開發可能會對這種特殊條件下的腫瘤血管生成產生更好的抑制效果。通過綜述相關文獻，我們認為放療相關腫瘤血管生成研究可在以下幾個方面進一步深化：1）放療相關腫瘤血管生成過程中的表觀遺傳調控機制；2）高LET射線放療（如碳離子）過程中腫瘤血管生成情況如何？是否需要與抗腫瘤血管生成藥物聯用？3）可動態監測腫瘤組織內部氧合程度和血管發生過程的非侵入性方法的開發；4）輻射誘導的非靶效應在腫瘤血管生成中作用如何？相信在科研人員和臨床醫生的共同努力下，在不久的將來，血管抑制劑聯合放療的治療方案將更加成熟和普及，對放療效果的改善將起到更為重要的推動作用。