雨生紅球藻caleosin基因的克隆、序列分析及表達特性

朱 琴，張宏江，張春輝，崔紅利，薛金愛，李潤植

（山西農業大學農學院分子農業與生物能源研究所，太谷 030801）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種單細胞真核綠藻，在分類學上屬于綠藻門（Chlorophyta）、紅球藻屬（Haematococcus）［1］。雨生紅球藻細胞在適宜環境條件下為含少量蝦青素的綠色游動形態，逆境條件下（如高光、高溫、高鹽）轉變為富含蝦青素的紅色不動細胞［2-3］。蝦青素（astaxanthin）是一種紅色酮式類胡蘿卜素，其抗氧化活性遠大于類胡蘿卜素和天然維生素E，被譽為“超級抗氧化劑”［4-5］。雨生紅球藻是目前已知的蝦青素含量最高的物種，在脅迫條件下蝦青素含量最高可達到細胞干重的6%［6］，因此被認為是提取天然蝦青素的理想材料［7］。

雨生紅球藻蝦青素主要是以酯化形式（蝦青素單酯和雙酯）存在，存儲于油體中［8］。油體又稱脂滴或脂質體，是高等植物種子、花粉、裸子植物種子、真菌和藻類中儲存中性脂質的細胞器［9-10］。油體主要分為三酰甘油（triacylglycerols, TAG）內層，磷脂單分子（phospholipids, PL）外層及鑲嵌其中的油體結合蛋白。目前在不同種子的油體中已鑒定出3類完整的油體結合蛋白，即油蛋白（oleosin）、鈣蛋白（caleosin）和甾體蛋白（steroleosin）［11］，它們廣泛存在于高等植物和藻類的油體中［12］。

油體結合caleosin和oleosin的結構相似，都具有穩定油體的功能［13］，形成差異的原因主要是這2種蛋白的3個結構域的長度不同：caleosin和oleosin分別有85%和55%的殘基在其N末端和C末端結構域中突出，并覆蓋于油體表面，其余15%和45%的殘基位于中央疏水結構域［14］。據推測，當使用相同量的三酰甘油時，等量的caleosin比oleosin能覆蓋更多的油體表面積，可見caleosin似乎是比oleosin更有效（或經濟）的結構蛋白［15］。caleosin在植物體中具有重要的生物學功能（如參與膜融合和脂肪體融合等過程）［16］，然而，與其他高等植物芍藥［16］、蓖麻［17］、油菜［18］等相比，藻類中油體結合蛋白的生理和功能特性仍缺乏研究，雨生紅球藻中還未見caleosin基因的相關報道。

本研究通過對雨生紅球藻caleosin（HaeClo）的基因進行分子克隆與表達分析,旨在揭示HaeClo蛋白的生物學功能，為HaeClo基因在植物基因工程、生物技術及生物化學的應用上提供科學依據，進而為通過遺傳改良HaeClo蛋白來提高雨生紅球藻蝦青素的含量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及培養條件

本試驗所用藻種為雨生紅球藻，現存于山西農業大學分子農業與生物能源研究所。將雨生紅球藻接種于MCM（modified Chalmers medium）培養基上，于（22.5±1.0）℃、光照條件下靜置培養，光照強度為1 300 lx，光 /暗周期為12 h/12 h，且每 8 h搖勻1 次。本試驗所用受體菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）BL21(DE3)，載體質粒為pET-28a(+)，均保存于山西農業大學分子農業與生物能源研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取

取對數期生長的雨生紅球藻作為試驗樣品，通過Takara公司的試劑盒，用TRizol法提取總核糖核酸（ribonucleic acid, RNA），操作步驟詳見說明書。所提RNA必須于-80℃冰箱中保存以避免降解。瓊脂糖凝膠電泳檢測后測其濃度和純度［19］。

1.2.2 cDNA模板制備和cDNA末端快速擴增技術（RACE）模板制備

本試驗用Takara公司的反轉錄試劑盒（Prime-ScriptTMRT Reagent Kit with Gdna Eraser）合成 cDNA模板，用Clontech公司的試劑盒（SMARTer TM RACE cDNA Ampli-cation Kit）制備cDNA末端快速擴增技術（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）模板，以上操作步驟詳見試劑盒說明書［20］。

1.2.3 同源克隆及RACE擴增

從NCBI GenBank中查找出與HaeClo基因序列親緣關系較近的4種綠藻：盤藻（Gonium pectoral）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、團藻（Volvox carteri f. nagariensis）和小球藻（Chlorellavulgaris）。序列比對獲得高度保守的氨基酸序列，用CODEHOP軟件設計HaeClo的同源克隆引物（F1，R1和F2，R2）。以制備的cDNA為模板結合設計的引物，按照TaKaRa LA Taq?擴增體系進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），從而獲得HaeClo的同源克隆片段。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶用于后續試驗。在此基礎上設計5'和3'端引物（5'RACE R3，R4和3'RACE F3，F4），以制備的RACE cDNA、5'和3'端引物為模板進行PCR擴增。將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后通過DNAStar軟件拼接，得到HaeClo基因cDNA序列全長，并據此設計表達框引物（F5，R5）。以上設計的引物信息均由上海生工生物工程公司合成，詳見表1。

1.3 生物信息學分析

HaeClo的生物信息學分析需要用到大量在線軟件和本地軟件，現將本試驗分析所用軟件名稱、用途及網址收集整合至表2。

表1 文中用到的引物信息Tab. 1 Primer information used in the article

表2 生物信息學分析資源Tab. 2 Bioinformatics analysis resources

1.4 HaeClo基因在脅迫條件下的表達分析

取對數期生長的雨生紅球藻作為試驗樣品，混勻后均分為6組，每組設3個平行，根據給予不同的脅迫處理分為以下試驗組別：正常光全氮組、高白光全氮組、高藍光全氮組、1/4氮組、高白光+1/4氮組及高藍光+1/4氮組，分別記為CK、HLW、HLB、1/4N、HLW+1/4N及HLB+1/4N。全氮及1/4氮處理根據MCM培養基中（NH4）MO7O24·4H2O和KNO3的濃度換算配制，高白光和高藍光光照強度為3 000 lx。在處理第0、1、2、3、4天時分別收集雨生紅球藻細胞樣品制備cDNA模板，然后進行熒光定量PCR分析HaeClo基因的表達。

1.5 HaeClo蛋白的原核表達和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

為了研究HaeClo蛋白的特性，本研究設計引物并進行ORF的PCR擴增，獲得了克隆載體，抽提質粒后將其與表達載體質粒pET-28a(+)分別進行雙酶切，切膠回收后的HaeCloORF片段和pET-28a(+)載體片段連接構成重組質粒pET-28a(+)-HaeClo，將重組質粒轉化到大腸桿菌感受態中誘導原核表達，以上操作步驟參考于曉娜［21］的方法。在28℃下用0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG）誘導轉化重組質粒的大腸桿菌BL21菌株，同時以相同條件處理的pET-28a(+)空載體做對照，分別在12 h和24 h取樣進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）檢測。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取與HaeClo基因克隆

圖1 雨生紅球藻總RNA的提取及HaeClo基因克隆電泳圖Fig. 1 Extraction of total RNA from H. pluvialis and electrophoresis of HaeClo gene cloningM ：Marker DL2000。M: Marker DL2000.

圖2 雨生紅球藻中HaeClo的核苷酸序列和氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequences and amino acid sequences of HaeClo in H. pluvialis紅色框標出的“ATG”代表起始密碼子，“TAG”代表終止密碼子。The “ATG” marked in the red box represents the initiation codon, and the “TAG” represents the termination codon.

如圖1中泳道所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測到RNA未發生明顯降解，其濃度和純度均在適宜范圍內，質量較好，可進行后續試驗。雨生紅球藻總RNA反轉錄后得到cDNA模板，結合設計的引物進行PCR擴增后獲得HaeClo的同源克隆片段，以制備的RACE cDNA和5'、3'端引物為模板進行PCR擴增，將獲得的雨生紅球藻5'端、中間片段和3'端序列拼接起來得到HaeClo基因的cDNA全長序列（NCBI注冊號：MT612719）。分析表明（圖2），HaeClo的cDNA序列全長為1 088 bp，共編碼262個氨基酸，編碼區從62～847共786 bp，其中5'-非翻譯區（5'-untranslation region, 5'-UTR）和3'-非翻譯區（3'-UTR）的長度分別為61 bp和241 bp，還帶有一個poly（A）尾巴。通過BLAST在線對HaeClo的氨基酸序列進行同源比對分析，結果表明，其與盤藻和萊茵衣藻來源的caleosin（NCBI檢索號見表3）相似性分別達到66%和61%。

2.2 HaeClo蛋白的理化性質分析

ProtParam軟件分析結果表明，雨生紅球藻中Hae-Clo蛋白的分子式為C1345H2067N351O378S9，理論等電點為7.73，屬于堿性蛋白。編碼該蛋白的氨基酸共有20種，其中含量較高的氨基酸為脯氨酸（Pro，8.8%）、賴氨酸（Lys，8.0%），而半胱氨酸（Cys，0.8%）和組氨酸（His，2.3%）的含量較低。帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）與帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）總數分別為31和30個。該蛋白的消光系數為53 525，吸光系數為1.815，平均親水系數為-0.413，不穩定性指數(II)為47.61，脂肪酸系數為77.74，因此我們將該蛋白質歸類為不穩定蛋白。

ProtScale軟件分析結果顯示：HaeClo蛋白親水性/疏水性分析最高值為2.556，位于第105和第106位氨基酸，最低值為-2.744，位于第167位氨基酸；該蛋白在中間區域存在一個明顯的疏水區，有較強的疏水性，在N端和C端氨基酸殘基區域都表現出較強的親水性。這表明HaeClo蛋白是一個兩末端區域為親水性、中間區域為疏水性的蛋白。

使用PSORT軟件對HaeClo蛋白的亞細胞定位進行預測，結果顯示，HaeClo蛋白定位于細胞質內，為胞內蛋白。NetPhos-3.1軟件預測到HaeClo蛋白的絲氨酸（Ser）最多，有29個，在C端分布比較緊密。蘇氨酸（Thr）的磷酸化位點有8個，酪氨酸（Tyr）的磷酸化位點最少，為4個。

2.3 HaeClo蛋白的高級結構分析

SOPMA軟件預測HaeClo蛋白二級結構結果顯示（圖3a），HaeClo蛋白中無規則卷曲（圖3a中紫色線條區域）所占蛋白質的比例最高（42.15%），α-螺旋（藍色線條區域）所占蛋白質比例次之（41.38%），此外，延伸鏈（紅色線條區域）和β-折疊（綠色線條區域）分別占10.34%和6.13%，由此可推測，HaeClo蛋白為混合型蛋白。圖3b為HaeClo蛋白的三級結構預測結果。NCBI-CDD軟件預測HaeClo蛋白在122～291位存在一個結構域，屬于典型的caleosin家族。SignalP 5.0軟件信號肽預測結果表明，編碼HaeClo蛋白的氨基酸序列中沒有信號肽剪切位點，由此可知，HaeClo為非分泌蛋白。

2.4 HaeClo蛋白的多序列比對分析

為了更好地研究HaeClo，本研究通過Clustal W和BioEdit軟件對HaeClo進行了多序列比對分析，結果顯示（圖4），目標序列HaeClo（用紅色標出)與從團藻（Volvocales）、小球藻（Chlorella）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativaL.）及芝麻（Sesamum indicum）等中分離的caleosin有相似的結構，參照Pasaribu等［22］的研究結果，將caleosin結構從上到下分隔標出區域，分別為N末端親水性鈣結合結構域、中央疏水性油體錨定結構域和C末端親水性磷酸化結構域。以上相關序列信息在表3中顯示。

表3 caleosin序列物種名稱及其登錄號Tab. 3 Caleosin sequence species name and their GenBank accession numbers

圖3 雨生紅球藻中HaeClo蛋白二級結構（a）和三級結構（b）的預測Fig. 3 The secondary structure (a) and tertiary structure (b) prediction of HaeClo in H. pluvialis

圖4 雨生紅球藻HaeClo與其他來源caleosin的部分序列比對Fig. 4 Partial sequence alignment of HaeClo in H. pluvialis with caleosins from other species鈣結合基序、脯氨酸結基序和酪蛋白激酶II磷酸化位點的片段用紅色方框標出，名稱在底部標出。The fragments of calcium binding motif, proline knot motif and casein kinase II phosphorylation site are marked with red boxes and the names are marked at the bottom.

2.5 HaeClo蛋白的系統進化分析

我們從NCBI數據庫搜集到20個物種的caleosin序列（包括高等植物和藻類）并進行了系統進化分析（MEGA-7軟件構建進化樹），以便更好地研究HaeClo與其他來源caleosin的進化關系。分析結果顯示（圖5），HaeClo與團藻、萊茵衣藻和盤藻等藻類來源的caleosin明顯聚為一支，高等植物類caleosin另聚為一支，兩支最終匯在一起。由此可見，HaeClo與其他藻類來源的caleosin親緣關系比高等植物類的caleosin親緣關系更近一些，追溯根源，它們可能具有共同的祖先和相似的功能。以上相關序列信息（包括物種名稱、簡寫及其登錄號）在表3中顯示。

圖5 雨生紅球藻HaeClo的系統進化樹分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of HaeClo in H. pluviali

2.6 HaeClo基因在脅迫條件下的表達分析

本文檢測了HaeClo基因在正常培養和其他不同脅迫條件下的表達譜（圖6a），結果顯示，在6種不同脅迫條件下，0 ～ 3 d時HaeClo基因的表達量逐漸上升，第3天時表達量均達到最高值，4 d后HaeClo基因的表達量開始下降。在處理第3天時，HLB+1/4N組HaeClo的表達量達峰值，比CK組的表達量提高了2.4倍，HLW+1/4N組HaeClo的表達量次之，HLB組HaeClo的表達量高于HLW組、1/4N組和CK組。取表達量最高的第3天進行半定量PCR分析檢測（圖6b），結果與圖6a表達一致。

圖6 雨生紅球藻HaeClo基因在不同處理下的表達分析Fig. 6 Expression analysis under different treatments of HaeClo gene in H. pluviali（a）熒光定量PCR；（b）半定量PCR(a) Quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction(qRT-PCR)； (b) Semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction (sqRT-PCR)

2.7 HaeClo蛋白的原核表達和SDS-PAGE分析

由圖7分析結果可以看出，與pET-28a(+)空載體相比較（泳道1、2），pET-28a(+)-HaeClo在29.5 kD的位置出現了新條帶（泳道3、4），大小均與預測蛋白大小相吻合，初步證明了pET-28a(+)-HaeClo在BL21菌株中表達成功。而比較不同的IPTG誘導時間可以看出，誘導24 h的蛋白表達量較誘導12 h的蛋白表達量有明顯提高。

3 討論

TAG是由內質網上脂肪酸合成相關酶催化合成的，caleosin合成后被運送到內質網上與已經合成的TAG結合形成復合體（即油體的前體），復合體經過多次融合后脫離內質網形成油體［23］。由此可見，caleosin是油體合成必不可少的物質。本研究通過克隆獲得雨生紅球藻caleosin基因，并對其編碼蛋白的理化特征及功能進行了分析，結果表明，HaeClo的cDNA序列全長為1 088 bp，共編碼262個氨基酸，含量最高的是脯氨酸（Pro），其中5'端和3'端長度分別為61 bp和241 bp，帶有一個poly（A）尾巴。HaeClo的氨基酸序列與盤藻和萊茵衣藻來源的caleosin相似性分別達到66%和61%，暗示該基因在雨生紅球藻中可能編碼caleosin蛋白，是油體合成必不可少的物質。

圖7 雨生紅球藻HaeClo原核表達和純化SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression and purification of HaeClo in H. pluvialiM ：蛋白質Marker；1～2 ：pET-28a（+）空載誘導12 h、24 h ；3～4 ：pET-28a（+）-HaeClo誘導12 h、24 h ；5 ：鎳柱親和純化后的目的蛋白。箭頭代表目的蛋白。M: Protein Marker； 1～2: pET-28a(+) no-load induction for 12 h, 24 h；3～4: pET-28a(+)-HaeClo induction for 12 h, 24 h； 5: Puri fied target protein after af finity puri fication on nickel column. Arrow represents the target protein.

丁勇等［24］的研究表明，caleosin的N末端親水性鈣結合結構域含有能結合1個鈣離子的EF-hand模體，這可能與鈣離子調控的信號轉導途徑有關。中間疏水性錨定結構域中的脯氨酸-結模體與α-螺旋域相鄰，一方面能在caleosin與油體及雙層內質網膜（endoplasmic reticulum, ER）的靶向過程中發揮作用，另一方面可以增加caleosin蛋白的疏水性，從而增加種子油體的穩定性［25］。HaeClo屬于典型的caleosin家族，其C末端結構域含有3個酪蛋白激酶II（casein kinase II, CKII）磷酸化位點，位于第142、144和163位氨基酸，可能參與鈣結合和翻譯后修飾（如二硫鍵和部分絲氨酸磷酸化），并在油體成熟及動員中傳遞信號，這與Purkrtova等［26］、丁勇等［24］的研究結果一致。多序列比對及系統進化分析驗證了HaeClo與其他來源的caleosin具有共同的祖先和相似的功能，進一步暗示了該基因在雨生紅球藻中可能編碼caleosin蛋白，從而增加油體的穩定性。

caleosin的特殊結構保持了油體之間的相互獨立和穩定，其中間疏水區域插入到油體內部，C末端和N末端留在油體表面，像許多樹杈將油體表面緊密包裹起來，形成一道屏障來保護油體［17］，從而使油體對高溫、強酸、強堿等有了一定的耐受能力［27］。在干旱［28］、低溫［29］、鹽脅迫［30］等逆境脅迫條件下，caleosin基因上調表達，同時植物合成大量油體。也有研究表明，caleosin基因可以調控脂肪酸的積累［17］。目前caleosin基因的克隆在植物中研究較多，在藻類中研究較少，且雨生紅球藻中caleosin的相關研究分析尚未見報道。本研究中，高白光、高藍光和缺氮等脅迫均有利于雨生紅球藻caleosin基因的上調表達，其中高藍光培養的效果大于高白光和缺氮培養，多因素組合脅迫（高藍/白光+1/4氮）效果大于單因素脅迫，這與翟映雪［31］、Katsuda等［32］研究中caleosin基因上調表達的同時植物大量合成油體的結果一致。Hae-Clo蛋白的原核表達和SDS-PAGE分析結果表明，目的蛋白在大腸桿菌中成功表達，可以進行下一步的功能研究。

本研究首次從雨生紅球藻中克隆獲得編碼Hae-Clo的cDNA序列并進行了生物信息學分析，同時對高光和缺氮等不同脅迫條件下的雨生紅球藻進行了半定量PCR和熒光定量PCR分析，進一步研究了HaeClo基因在雨生紅球藻中的表達，為HaeClo基因在植物基因工程、生物技術及生物化學上的應用提供了科學依據，進而為探究雨生紅球藻中HaeClo調控雨生紅球藻油脂含量、蝦青素含量以及蝦青素在油體儲存的相關機制等方面奠定了基礎。