鈉通道NaV1.9與疼痛的研究進展

何 詢，周 熙

（1. 深圳未名新鵬生物醫藥有限公司，深圳 518057；2. 湖南師范大學生命科學學院動物多肽藥物創制國家地方聯合工程實驗室，長沙 410081）

疼痛本是機體自我保護的一種機制，是一種重要的生理功能。然而在神經損傷、癌癥、糖尿病、病毒感染以及某些炎癥等病理條件下，疼痛會演變成慢性衰弱性疾病，即慢性疼痛，例如癌痛、糖尿病性神經痛、皰疹后神經痛等。保守估計，全球有將近五分之一的人常年遭受慢性疼痛的困擾［1］。目前臨床上用于治療疼痛的鎮痛藥物有非甾體類抗炎藥、阿片類藥物、局部止痛藥、抗驚厥類藥物、三環類抗抑郁藥等［2］。盡管如此，上述鎮痛藥物仍存在專一性低、長期使用副作用大、具有成癮性等問題，特別是近年來阿片類藥物的濫用引發的不良社會問題日益尖銳。因此，新靶點新機制的鎮痛藥物的研發是生物和醫藥領域關注的熱點方向。

電壓門控鈉通道在電信號的起始和傳導中扮演了重要角色，其功能異常可能與多種慢性疼痛的發病機制相關，因此一直是鎮痛藥物研發的重要靶點［3］。在9個鈉通道亞型中，電壓門控鈉通道NaV1.7、NaV1.8和NaV1.9特異性表達于外周神經系統（如背根神經節、三叉神經節等外周傷害感受神經元），調控外周疼痛信號通路［3］。臨床前動物模型以及臨床遺傳學的研究表明，這3個鈉通道在正常的生理以及病理性疼痛感受中扮演著重要角色。目前，有多個針對神經病理性疼痛的NaV1.7和NaV1.8的抑制劑正處于臨床研究階段［4-5］。據Cortellis（http://cortellis.thomsonreuterslifesciences.com）數據顯示，現在共有40個NaV1.7抑制劑正處于臨床研究階段，其中Newron Pharmaceuticals公司研發的針對神經病理性疼痛的鎮痛藥物Ral finamide正處于臨床三期研究階段。然而，至今仍未有關于靶向NaV1.9的臨床前或臨床研究中的藥物報道。本文將對NaV1.9與疼痛的關系以及靶向鎮痛藥物的開發進行綜述和探討。

1 NaV1.9的表達定位和生理學特性

在初級感覺神經元中分布有一系列特殊的離子通道和受體，這些離子通道和受體響應外界刺激（如化學、機械和溫度等），引起局部的膜電位去極化，從而產生電信號將信息傳入中樞。NaV1.9主要分布在無髓鞘的C-fiber末梢可被IB4標記的非肽能背根神經節（dorsal root ganglion, DRG）的神經元上（圖 1），同時也在三叉神經節神經元和腸肌層神經元中高表達［6-7］。眾多研究表明，NaV1.9參與了上述神經元電信號的產生與傳導。

NaV1.9在亞細胞中的定位受蛋白質翻譯后修飾和膜轉運調控。輔助亞基β 1和β2能顯著上調NaV1.9在異源細胞HEK293T質膜上的功能性表達［8］。體外試驗發現，細胞黏附蛋白可直接作用于NaV1.9的C末端，并且上調NaV1.9在質膜上的表達；而當細胞黏附蛋白被敲除后，IB4標記的神經元中NaV1.9的電流密度顯著降低，表明細胞黏附蛋白能直接與NaV1.9相互作用來促進NaV1.9的跨膜轉運［9］。

相比于其他鈉通道，NaV1.9具有獨特的電生理特性。在靜息膜電位時，NaV1.9能響應閾下刺激產生持續鈉離子內流，使細胞膜去極化；而在動作電位時，其能作為“閾值通道”來影響神經元的興奮性。Herzog等［10］通過計算機模擬發現，即使將DRG胞體中NaV1.9在細胞膜上的表達豐度降低到50%，其對細胞膜的去極化仍具有相當大的貢獻（仍能大于正常水平時的75%）。因此，根據NaV1.9的組織分布特性和電生理特征，我們推測它在疼痛信號的產生和傳導中應具有重要的作用。

圖1 NaV1.9在DRG神經元中的分布［6］Fig. 1 Distribution of NaV1.9 in DRG neurons［6］（a）NaV1.9在表皮內神經纖維中的表達，其與蛋白基因產物PGP9.5存在共定位，圖中黃色顯示兩者共定位；（b）NaV1.9在DRG神經元中與IB4存在非常高的共定位，但不與降鈣素基因相關肽共定位；（c）脊髓后角淺層DRG神經元突觸前神經末梢顯示有NaV1.9的免疫染色；（d）NaV1.9在皮膚初級傳入神經末梢、DRG胞體和中樞神經末梢分布的模式示意圖。PGP9.5：蛋白基因產物9.5；CGRP：降鈣素基因相關肽 ；DRG ：背根神經節 ；Sc：角質層 ；Sl；透明層 ；Sb ：基底層 ；Ss：棘皮層 ；Sg ：顆粒層 ；Ⅰ：板層Ⅰ；Ⅱ：板層Ⅱ；Ⅲ：板層Ⅲ；Ⅳ：板層Ⅳ。(a) Expression of NaV1.9 in intraepidermal nerve fibres, colocalization of NaV1.9 and PGP9.5 is shown in yellow； (b) DRG neurons display substantial colocalization of NaV1.9 with the isolectin IB4 (green) but not with calcitonin gene-related peptide (CGRP, blue)； (c) Presynaptic nerve terminals of DRG neurons in the super ficial layers of the dorsal horn of the spinal cord display NaV1.9 immunostaining； (d) A schematic representing the localization of NaV1.9 channels at primary afferent peripheral nerve endings in the skin, in DRG somata and in central nerve endings. PGP9.5: Protein gene product 9.5； CGRP: Calcitonin gene-related peptide； DRG: Dorsal root ganglion； Sc: Stratum corneum；Sl: Stratum lucidum； Sb: Stratum basale； Ss: Stratum spinosum；Sg: Stratum granulosum； Ⅰ: Lamina Ⅰ； Ⅱ: Lamina Ⅱ； Ⅲ: Lamina Ⅲ；Ⅳ: Lamina Ⅳ.

2 NaV1.9在疼痛中的作用

2.1 動物模型試驗

野生型小鼠在炎癥反應后會對機械和溫度產生超敏，然而NaV1.9基因敲除小鼠在炎癥反應后對機械和溫度刺激的敏感度顯著下降，這表明 NaV1.9 可能參與了炎癥的超敏反應［11］。另一項動物模型試驗表明NaV1.9參與炎性疼痛。當大鼠后肢產生炎癥反應后，支配其后肢的DRG感覺神經元中NaV1.9的表達增加［12］。炎性疼痛時，NaV1.9功能上調的現象存在2種可能的機制：1）炎性因子增加，促使NaV1.9功能上調；2）炎癥引起膽固醇含量降低，促使NaV1.9功能上調。當組織損傷時，損傷細胞釋放大量的炎性因子，如 H+、緩激肽、組胺、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）、三磷酸鳥苷 （guanosine triphosphate,GTP）、五羥色胺、神經營養因子、前列腺素2等。這些炎性因子可直接或間接增強NaV1.9的功能，降低動作電位爆發的閾值，從而增強神經元的興奮性，并且在給予相同的去極化刺激時，炎性因子處理的DRG神經元的動作電位爆發頻率增加［13］。在產生炎性因子的同時，炎癥反應也降低了局部膽固醇的含量。膽固醇含量的降低可以使傷害感受神經元敏感化，促進機械和熱痛覺過敏。Amsalem等［14］通過NaV1.9敲除小鼠動物模型和細胞電生理試驗證明了膽固醇含量降低能激活NaV1.9而增強神經元的興奮性，從而對機械刺激和熱痛覺產生超敏反應。

Luiz等［15］發現，NaV1.9在三叉神經痛相關的神經性口面部疼痛的發展中起著重要作用。敲除NaV1.9并不影響小鼠正常的面部疼痛行為（機械和熱刺激），然而在面部眶下神經壓迫（constriction of the infraorbital nerve, CION）的神經性疼痛模型（該模型誘導面部超敏的神經性疼痛，并且可以導致長達3周對機械刺激超敏感）中，相對于野生型小鼠，NaV1.9敲除小鼠的面部區域對機械和熱刺激的敏感性顯著下降，并且也去除了模型小鼠的持續性機械超敏感。

長期或過量使用一些非處方或鎮痛藥（如撲熱息痛、類阿片和聯合鎮痛藥）將可能導致藥物過度使用性頭痛（medication-overuse headaches, MOH）。Bonnet等［16］發現這可能與NaV1.9存在一定的關系。他們發現治療偏頭痛的曲坦類藥物導致的MOH癥狀和一氧化氮（NO）異常激活NaV1.9有關。當敲除NaV1.9的基因后，MOH癥狀小鼠未表現出NO介導的癥狀，這些癥狀包括頭皮異常性疼痛、光和聲音恐懼癥。同時，NaV1.9的非正常激活能觸發降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）的釋放，引起動脈擴張和肥大細胞脫顆粒。反過來，肥大細胞釋放的炎性因子能促進NaV1.9表達上調，從而加重炎癥和疼痛信號。

Lolignier等［17］發現，NaV1.9在冷刺激引發的疼痛感受中扮演了重要的角色。在有害冷環境中，冷敏感的感覺神經元中NaV1.9電流上調，閾下刺激放大，神經元放電增加，從而導致冷痛。在NaV1.9敲除的小鼠中，冷刺激誘發的冷痛和奧沙利鉑化療后的疼痛性冷超敏反應均有所降低。

另外，也有研究指出，在大鼠骨癌痛模型中，DRG神經元中NaV1.9的mRNA水平和蛋白質水平在腫瘤的不同發展階段較對照組均有顯著的上升，表明NaV1.9 可能參與了骨癌疼痛的發展與維持［18］。

綜上所述，動物模型研究表明，NaV1.9在炎性疼痛、神經性疼痛和冷痛中均扮演了重要角色。

2.2 人類臨床相關疾病的研究

近些年來，高通量測序技術的發展加速了人類對罕見遺傳疾病的研究。在人類的疼痛研究中，一些罕見的遺傳性疼痛和外周神經痛疾病與編碼NaV1.9的基因SCN11A的突變相關［6］。目前共鑒定有18個不同位點的突變，可劃分為3類不同的疼痛疾?。?）先天性無痛癥；2）家族性發作性疼痛；3）小纖維神經痛。2013年，德國科學家Leipold等［19］首次在Nature Genetics上報道，NaV1.9功能獲得性突變L811P能導致患者先天性無痛癥，該患者不能感知有害的疼痛刺激，并伴隨有自殘行為和無痛性骨折。同年，我國學者劉靜宇教授、姚鏡教授及張學教授等［20］合作的研究發現，2個發作性疼痛家系分別與NaV1.9的R225C和A808G突變相關；功能學研究表明，2個位點的突變均增加了DRG神經元的興奮性。2014年，Huang等［21］對345個外周神經病理性疼痛散發患者的疼痛相關基因進行了篩查，發現11個病例的SCN11A基因發生突變，共涉及8個不同位點的突變。作者對其中2個突變I381T和L1158P進行了功能性分析，發現突變通道可導致激活曲線向超極化方向漂移，增大了窗口電流，并使去激活變慢。電流鉗試驗發現，這2個突變增加了DRG神經元動作電位的自發性爆發，也增加了誘發的動作電位頻率。這3個研究工作在NaV1.9遺傳學研究中具有代表性，拉開了深入研究NaV1.9在疼痛中角色的序幕。因此，基于上述人類遺傳學的研究充分證明了NaV1.9在痛覺產生及痛覺異常的疾病中發揮了重要作用。

2019年，Salvatierra等［22］發現NaV1.9可能在瘙癢中也扮演了重要角色。他們發現該通道L811P突變的病人雖表現出對疼痛不敏感，但卻伴隨有嚴重的瘙癢行為。作者隨后構建同源突變敲入小鼠（NaV1.9L799P/WT）和NaV1.9敲除小鼠對其進行了研究，發現致癢原引起了野生型小鼠強烈的急性瘙癢反應，NaV1.9敲除小鼠致癢原引起的急性瘙癢行為卻顯著降低。然而，NaV1.9L799P/WT小鼠在安靜狀態下表現出比野生型小鼠更多的自發性瘙癢。通過細胞試驗表明，致癢原（如組胺）引起瘙癢的原因可能是其增強了NaV1.9的活性從而改變了動作電位的特性。在另一項研究中，Zhou等［23］發現組胺可直接增強NaV1.9電流，說明組胺不僅可作為炎性因子激活NaV1.9致痛，也可作為致癢原激活NaV1.9導致瘙癢。這些研究表明，NaV1.9可能是治療瘙癢的一個藥理學靶點。

3 NaV1.9的藥理學研究

動物模型和臨床遺傳學研究表明，NaV1.9在疼痛信號通路中扮演了重要角色，是一個潛在的鎮痛藥物開發靶點。但相對于其他鈉通道亞型，NaV1.9的研究要滯后得多，其功能和藥理學相關的直接證據相對較少，極大地限制了其藥理學研究和新藥研發的進展。這主要是因為長時間以來NaV1.9無法實現異源細胞的功能性表達，缺少藥理學調制劑，難以通過電生理試驗對其功能和藥理學進行系統研究［6］。近幾年來，共有4個不同的NaV1.9異源表達體系被建立，其能在如HEK293、ND7/23和CHO-K1等異源細胞上表達出幅度大且穩定的電流。利用建立的異源表達系統，結合動物模型等研究，Zhou等［24］從白額巨蟹蛛毒液中發現蜘蛛的多肽毒素HpTx1能激活NaV1.9，增強神經元的興奮性，從而誘發小鼠的傷害感受疼痛行為，降低機械痛和熱痛閾值。值得注意的是，HpTx1通過激活NaV1.9而逆轉NaV1.7敲除小鼠的無痛反應這一發現可能為治療NaV1.7相關的先天性無痛癥提供新策略和新靶點，為相關藥物研發提供新思路。同時該研究也為NaV1.9 在疼痛感知中的重要角色提供了藥理學證據支持。此外，Zhou等［24］進一步分析了蜘蛛多肽毒素HpTx1作用于NaV1.9通道上的關鍵位點，發現它是通過與NaV1.9的第4個電壓敏感結構域相結合來阻礙通道快失活的，說明NaV1.9類似于另外8種亞型，其第4個結構域跟通道快失活相關。因此，該研究也表明NaV1.9具有與其他鈉通道亞型相類似的多肽毒素結合區域和功能特征。

Liang等［25］研究發現，阿密曲替林（amitriptyline，一種三環類抗抑郁藥，也對偏頭痛有很好的治療效果）對三叉神經節中NaV1.9電流也有阻斷作用，能使穩態失活曲線向超極化方向顯著地漂移且不影響穩態激活，這樣將導致通道更容易失活而抑制NaV1.9電流。

Lin等［8］發現多個化合物（包括阿密曲替林、利多卡因、苯唑卡因、布比卡因、氟卡尼、拉莫三嗪、美西律、TC-N 1752、丁卡因和尼莫地平）對NaV1.9均有抑制作用。當NaV1.9上相對應的經典局部麻醉劑作用位點F1592和Y1599雙突變成丙氨酸時，阿密曲替林、利多卡因、苯唑卡因、美西律、TC-N 1752和丁卡因對突變后通道的親和力均有不同程度的下降，其中利多卡因和TC-N 1752的親和力下降約100倍。它表明這些化合物相互作用于通道第4個結構域的第6個跨膜片段內環上經典的局部麻醉劑結合位點。由此說明，NaV1.9跟其他鈉通道一樣，可被廣譜活性的局部麻醉類藥物抑制。

4 總結與展望

綜上所述，NaV1.9在炎性疼痛、神經病理性疼痛和冷痛中發揮了重要作用，也可能在癌痛和內臟痛中有一定作用。NaV1.9在組織表達中的特異性和一級序列的獨特性賦予了其成為開發特異性作用藥物靶點的潛力，可降低藥物脫靶而導致的副作用。再者，所有發現的NaV1.9遺傳突變病例除了有疼痛紊亂的癥狀外，并沒有其他如智力和認知等方面的問題，故可推測靶向NaV1.9通道不會引起不良的認知缺陷。目前研究也表明，多肽毒素或炎性因子等能增強NaV1.9功能而誘發疼痛或疼痛加劇，這從藥理學方面揭示了NaV1.9與疼痛的重要關系。因此，NaV1.9可能是一個較為理想的潛在鎮痛藥物靶點，其特異性抑制劑可能不會對心臟、骨骼肌和認知等功能產生影響。然而有報道發現，NaV1.9在大鼠下丘腦視上核大神經分泌細胞中有表達，其可能對該細胞的放電有貢獻［26］，說明在藥物研發中，NaV1.9抑制劑（特別是可穿透血腦屏障的抑制劑）對下丘腦功能的影響是需要謹慎對待和評估的。此外，有報道也表明，NaV1.9在腸神經元中有高表達，參與腸神經元的興奮性，其功能上調可增強腸傳入神經的放電，導致腸神經元的興奮性增加，腸組織機械超敏［27］。這在一定程度上說明NaV1.9可能與腸道疼痛相關，特別是臨床上部分NaV1.9突變的患者存在不同程度的腸道功能紊亂（如腹瀉、便秘、疼痛等）的現象也為該觀點提供了一定的支持。但NaV1.9與內臟痛的關系仍不明確，其參與內臟痛的作用分子機制仍不清楚，同時抑制NaV1.9對腸道正常生理功能的影響也不清楚，需要進一步的系統研究?？偟膩碇v，NaV1.9調控外周疼痛信號，是一個潛在的鎮痛藥物研發靶點，但仍充滿未知，機遇與挑戰并存。

基于目前的研究現狀，靶向NaV1.9的藥物研發還任重道遠。目前還沒有高親和力和高專一性的NaV1.9調制劑，需要加大篩選力度。蜘蛛、蜈蚣、蝎子等有毒動物富含多肽毒素，它們是有毒動物在億萬年進化過程中的產物，具有驚人的分子多樣性、結構多樣性和功能多樣性，是新藥研發的重要資源寶庫，也是當前新藥篩選的一個重要方向。此外，某些對鈉通道具有狀態依賴性的小分子抑制劑具有較高的專一性和親和力（如現在多個進入臨床的NaV1.7小分子抑制劑）［4］，因此，狀態依賴性的小分子篩選也是一個重要的方向。當前，隨著結構生物學的快速發展，特別是冷凍電鏡在結構生物學中的應用，之前難以解析的膜通道蛋白現在可以呈現近原子或原子水平的清晰三維結構，為基于結構的藥物設計提供了良好的模板和分子基礎。目前已有4個哺乳動物鈉通道亞型（NaV1.2、NaV1.4、NaV1.5和NaV1.7）的結構被解析?；诖?，通過分子動力學模擬結合人工智能、計算機輔助藥物設計等技術篩選和設計靶向NaV1.9的藥物將成為可能，這也是靶向NaV1.9藥物研發的一個重要方向。所以，在現在已具備NaV1.9異源表達體系的情況下，多方面資源與技術的結合將會加速作用于NaV1.9調制劑的篩選，促進靶向NaV1.9的藥物研發。