基于FA修飾的CS@Fe-TiO2復合納米顆粒體外PDT滅活HL60細胞的試驗研究

劉麗玲，趙 楊，張啟云，方 杰，陳 麗，艾保全，熊建文*

（1. 華南師范大學物理與電信工程學院，廣州 510006；2. 廣東工業大學物理與光電工程學院，廣州 510006）

光動力療法（photodynamic therapy, PDT）是近年興起的一種旨在選擇性消除癌細胞的非手術方法，因其具有療效準確、復發率低、創傷性小等優點而成為治療白血病的新方法［1-2］。PDT具有三大基本要素：光敏劑、光源及組織氧濃度［3］，其中光敏劑是PDT的核心要素，因此研制新型高效的光敏劑就成為一個重要的工作。TiO2納米顆粒被認為是PDT中的一種潛在光敏劑，但由于純TiO2具有較寬的帶隙（3.2 eV）寬度，使其可見光響應較低，表面生成的電子和空穴復合率高，此外TiO2的熱力學性能不穩定導致其易團聚，因而在PDT的臨床應用中受到了一定的限制［4］。

為了解決上述難題，國內外諸多研究學者對TiO2進行了改性研究（例如非金屬摻雜、金屬摻雜、半導體復合、量子點修飾等［5-9］），使其光催化活性得到了顯著提高。其中鐵的摻雜能很好地改善TiO2的性能，使其在可見光波段的吸收光譜顯著紅移［10］，但暴露在TiO2表面的金屬離子可能會對細胞產生細胞毒性。近來的研究表明，殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然、無毒、具有良好生物相容性的氨基多糖，可被不同的水解酶降解。該生物聚合物在生物體抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面具有廣闊的應用前景［11-12］，其在酸性介質中的聚陽離子性質有利于與多陰離子的物質形成強靜電相互作用，能夠有效地發揮生物載體的功能［13-14］。

本文選用CS對Fe-TiO2進行包裹，以三聚磷酸鈉為聚陰離子模板分子誘導CS形成CS@Fe-TiO2納米顆粒［12］，將TiO2的吸收光譜拓展至可見光區，使其具有良好的生物相容性。此外，為了增強CS@Fe-TiO2光動力治療白血病的效果，本研究進一步使用了對癌細胞具有靶向作用的葉酸（folic acid, FA）對其進行修飾，以實現其對癌細胞的特異性結合，從而達到提高PDT滅活HL60細胞的效率。此外，本文將FACS@Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2對HL60細胞的滅活效果進行了對比，并深入探究了PDT滅活HL60細胞的作用機理。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞株

早幼粒細胞白血病的細胞系（HL60）由中山大學動物中心細胞庫提供。

1.2 試劑與儀器

鈦酸丁酯，硝酸，硝酸鐵（FeN3O9·9H2O），三聚磷酸鈉，冰乙酸，無水乙醇，FA（C19H19N7O6，≥99.9%），CS（脫乙酰度≥95%），二甲基亞砜［（CH3）2SO］，三乙胺（C6H15N，≥99.5%），N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，C4H5NO3，≥98%），臺盼藍試劑（美國 Invitrogen），CCK-8（cell counting kit-8）試劑（日本同仁化學研究所），四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF，天津 致遠），活性氧檢測試劑（普利萊），RPMI-1604培養基（美國Gibco）。

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM），X射線粉末演示儀（德國 Bruker），傅里葉紅外光譜儀（Nicolet6700，美國 熱電尼高力），UV-1700紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu），WFY-28型熒光分光光度計（天津 拓普），超微振蕩器（姜堰 新康），SK2510LHC超聲儀（上海 科導），磁力加熱攪拌器（江蘇 科析），酶標儀（美國 Bio Rad），CountessTM型自動細胞計數儀（美國 Invitrogen），PDT反應室（自行設計），SW-CJ型潔凈工作臺（蘇州 安泰），HH·CP-TW（80 L）二氧化碳培養箱（上海 一恒科技），干燥箱，96孔板及細胞計數板等其他常規器皿。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備復合納米顆粒FA-CS@Fe-TiO2

Fe-TiO2的制備：室溫下，將20 mL鈦酸丁酯與10 mL無水乙醇混合，磁力攪拌30 min后得到A溶液；稱取質量為0.458 g的硝酸鐵（FeN3O9·9H2O）加入到無水乙醇中，超聲分散至完全溶解得到B溶液；在磁力攪拌的狀態下將B溶液緩慢加入A中，并用適當的硝酸調節溶液的pH，繼續攪拌1.5 h直至形成均勻透明的溶膠；溶膠經陳化、干燥和熱處理得到摻鐵量為2%的Fe-TiO2。用同樣的方法制得純的TiO2。

CS@Fe-TiO2的制備 ：取0.100 g的三聚磷酸鈉溶于10 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min后得A液；取0.250 g的CS溶于10 mL的冰乙酸中，磁力攪拌2.0 h 后得 B液 ；取0.500 g的 Fe-TiO2超聲分散于10 mL的無水乙醇中直至完全溶解得C液；先將A液緩慢滴入B液中，隨后將C液緩慢滴入并不斷攪拌得混合液D；室溫下磁力攪拌3.0 h完成官能化后用去離子水清洗3次，離心后于80℃下真空干燥，所得納米顆粒命名為CS@Fe-TiO2（1:1）。用同樣的方法制得CS@Fe-TiO2（3:2）和 CS@Fe-TiO2（2:1）。

FA的活化及對CS@Fe-TiO2的修飾：稱0.500 g的CS@Fe-TiO2（1:1）于10 mL的冰乙酸中充分溶解得I液 ；取0.180 g三乙胺和0.500 g FA加入到20 mL的二甲基亞砜中，磁力攪拌2.0 h后，稱取0.260 g羥基琥珀酰亞胺、0.470 g二環已基碳二亞胺加入到上述混合溶液中，黑暗條件下反應12.0 h后過濾，在濾液中緩慢加入I液，常溫下攪拌12.0 h后離心、干燥、研磨，所制備的納米顆粒命名為FA-CS@Fe-TiO2（1:1）。用同樣的方法制得FA-CS@Fe-TiO2（3:2）和FA-CS@Fe-TiO2（2:1）。

1.3.2 FA-CS@Fe-TiO2復合納米顆粒的表征手段

用掃描電子顯微鏡對CS@Fe-TiO2復合納米顆粒進行成像分析，檢測樣品的分散性；用傅里葉紅外光譜（Fourier transformation infrared spectrum, FTIR）儀測量顆粒的成分 ；用X射線衍射（X-ray diffraction, XRD）儀檢測樣品的衍射峰，并根據衍射圖譜檢測樣品的組成 ；用熒光光譜（ fl uorescence spectre, FS）分析其激發、發射光譜范圍和強度等。

1.3.3 HL60細胞的培養與計數

將HL60細胞接種于完全RPMI-1640培養基中，再把整個培養基放入37℃、5%CO2、95%空氣濕度的二氧化碳培養箱中培養。培養適當時間后換液打散至細胞液均勻，取此細胞液與臺盼藍按1:1的體積比混合并迅速滴至細胞計數板上，隨后將細胞計數板插入CountessTM型自動細胞計數儀中計數。細胞數量滿足試驗要求后，取此處于對數生長期的細胞進行試驗。

1.3.4 FA-CS@Fe-TiO2復合納米顆粒對HL60細胞的暗毒性試驗及PDT試驗

根據試驗內容規劃96孔培養板，分為非光照組和光照組。非光照組包括遮光板（A板、C板），光照組包括光照板（B板、D板），每個板均設置對照組和試驗組。為了減少試驗誤差，同一條件下均設置3個重復孔。取對數生長期濃度為3.5×105個/mL的HL60細胞接種到已規劃好的96孔板中，對照組和試驗組每孔均接種100 μL的細胞液；接著在試驗組中加入終值質量濃度分別為5、10、20、40、80、160 μg/mL的TiO2、Fe-TiO2、CS、CS@Fe-TiO2、FA-CS@Fe-TiO2溶液各100 μL，而對照組中每孔各加入100 μL血清含量為10%的RPMI-1640培養液，隨后把96孔板放到微量震蕩儀中震蕩3 min，再用無水乙醇擦拭96孔板消毒后置于培養箱中培養。其中，光照板（B、D板）培養12.0 h后置入波長為 410 nm、光功率為5 mW/cm2的光動力輻照室中光照1.0 h再繼續培養；而遮光板（A、C板）則連續避光培養12.0 h。然后每孔均加入20 μL的CCK-8試劑［15］，震蕩均勻后用無水乙醇擦拭消毒，置入培養箱中再培養3.0 h。使用酶標儀對上述的試驗組和對照組進行細胞活性的吸光度檢測，設定450 nm為測量波長，630 nm為參比波長。

1.3.5 數據處理與分析

試驗數據主要采用Origin8、Mathtype、SPSS11.5軟件進行處理，結果用均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 復合納米顆粒FA-CS@Fe-TiO2的表征

2.1.1 SEM成像分析

圖1 TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2納米顆粒的SEM圖Fig. 1 SEM images of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 nanoparticles（a）TiO2納米顆粒SEM圖 ；（b）Fe-TiO2納米顆粒SEM圖 ；（c）CS@Fe-TiO2納米顆粒SEM圖。(a) SEM image of TiO2 nanoparticles； (b) SEM image of Fe-TiO2 nanoparticles； (c) SEM image of CS@Fe-TiO2 nanoparticles.

采用掃描電子顯微鏡對樣品的表面形貌進行觀察。如圖1所示分別為TiO2、Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2納米顆粒的SEM圖像。由圖1a、1b可知，Fe的摻雜可以很好地改善TiO2的團聚現象，但Fe摻雜后的納米顆粒較大。而由圖1c可知，經CS的包裹后，納米顆粒的外觀形貌發生了改變，在更高的放大倍率下，可見納米化的CS@Fe-TiO2結構致密，成橢球形或扁球形顆粒，雖然存在少數小的聚集體，但其粒徑大約在30～50 nm之間，細胞仍能攝?。?，13］。

2.1.2 XRD分析

如圖2所示，由曲線a可知，在2θ為25.38°、37.85°、48.13°、53.96°、55.18°、62.79°、68.86°、75.40°等處出現了分別對應銳鈦礦（101）、（004）、（200）、（105）、（211）、（204）、（116）、（215）晶面的衍射峰；由曲線f可知，在2θ=10.62°、19.88°處出現了純CS的2個主要特征峰，在29.60°、35.88°和40.10°附近呈現出小的額外峰值，這種類似的結果與Zhu等［16］的研究結果一致。此外可看出，曲線c、d、e的衍射峰值除了與TiO2材料的銳鈦礦相相關外，在2θ=10.62°處還出現了屬于CS的特征峰。因此，XRD結果證實了CS@Fe-TiO2納米復合材料體系的形成。

圖2 TiO2、CS@Fe-TiO2納米顆粒的X射線衍射譜Fig. 2 XRD patterns of TiO2, CS@Fe-TiO2 nanoparticles

2.1.3 傅里葉紅外光譜分析

圖3為各納米顆粒的傅里葉紅外光譜圖。在圖3a中，曲線（1）、（2）均在804.00 cm-1左右出現了Ti-O鍵相對應的特征峰，但曲線（2）中Ti-O鍵的伸縮振動峰明顯減弱，說明Fe已取代Ti成功地摻入TiO2內部。曲線（3）為純CS的光譜圖，在1 592.32 cm-1處出現的吸收峰為氨基的振動峰，在1 061.98 cm-1和1 150.79 cm-1處分別出現了歸因于N-H的伸縮振動峰和-OH的伸縮振動峰，并且在3 360.95 cm-1和2 871.75 cm-1處出現了屬于羥基和C-H基團的振動峰［17-18］。通過對曲線（4）的紅外光譜分析可知，復合納米顆粒中的C-O、氨基和羥基的伸縮振動與CS的官能團一致，表明CS生物大分子包裹了納米顆粒Fe-TiO2［19］。

如圖3b所示，曲線（1）在2 925.00～3 545.00 cm-1處出現的吸收峰，表示FA中出現了蝶呤環的-NH....H伸縮振動峰以及谷氨酸的-OH伸縮振動峰。在1 694.00 cm-1和 1 640.00 cm-1處出現了歸因于谷氨酸中-COOH基團的C=O和-CO-NH-中C=O的伸縮振動峰。此外，在1 485.00 cm-1與 1 414.00 cm-1處還顯示出苯環的伸縮振動峰和苯酚-OH的振動吸收峰［20］。曲線（2）是NHS-FA的紅外光譜圖，在1 201.00 cm-1和1 068.00 cm-1處出現的吸收峰值代表C-O和N-O的伸縮振動峰。而在1 729.00 cm-1處出現了新的振動吸收峰，其原因為羥基琥珀酰亞胺中苯環上的-OH的分裂并與FA的C=O連接形成了琥珀酰亞胺酯。對比曲線（2）、（3）、（4）可知，NHS-FA與CS@Fe-TiO2在1 400.00 cm-1處均出現了表示-C-O的特征峰。值得注意的是NHS-FA在1 206.34 cm-1的吸收峰即NHS酯上的羰基峰，在修飾后的納米顆粒FA-CS@Fe-TiO2上消失了，說明FA活性酯有了明顯的變化。而FA-CS@Fe-TiO2的圖譜中出現了FA的δC-H特征峰和酰胺鍵υC=O特征峰，說明FA與CS@Fe-TiO2已成功連接上。

2.1.4 紫外-可見光（UV-Vis）吸收光譜和光源分析

通過測試得TiO2、Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2的紫外-可見吸收光譜（ultraviolet and visible spectroscopy, UVVis）如圖4a所示，TiO2的吸收光譜主要位于390 nm以下且吸收峰不強，但經過Fe與CS的摻雜后，可以看出CS@Fe-TiO2在410～420 nm UV-Vis范圍內吸收明顯增強，說明TiO2的團聚會影響其對光的吸收，而Fe、CS的摻雜能有效提高TiO2在紫外-可見光照下的光催化活性，且隨著CS含量的增加，吸收光譜發生紅移的現象越來越明顯。圖4b是本實驗室所使用的光動力試驗光源（light emitting diode, LED）的發射光譜，其發射峰為410.17 nm，滿足可見光激發此納米材料的條件，能有效發生光催化反應。

2.2 復合納米顆粒對HL60細胞的暗毒性試驗

圖3 不同納米顆粒的傅里葉紅外光譜Fig. 3 FTIR of different nanoparticles（a）TiO2、Fe-TiO2、CS、CS@Fe-TiO2 納米顆粒的FTIR圖 ；（b）CS@Fe-TiO2、FA、NHS-FA、FA-CS@Fe-TiO2納米顆粒的FTIR圖。(a) FTIR of TiO2, Fe-TiO2, CS, CS@Fe-TiO2 nanoparticles； (b) FTIR of CS@Fe-TiO2, FA, NHS-FA, FA-CS@Fe-TiO2 nanoparticles.

圖4 納米顆粒的UV-vis吸收光譜與光動力試驗箱LED陣列的發射光譜Fig. 4 UV-vis spectrum of nanoparticles and emission spectrum of LED arrays of PDT irradiation chamber（a）納米顆粒的UV-vis吸收光譜；（b）光動力試驗箱LED陣列的發射光譜。(a) UV-vis spectrum of nanoparticles； (b) Emission spectrum of LED arrays of PDT irradiation chamber.

圖5分別為非光照條件下TiO2、Fe-TiO2、CS以及不同質量比的CS@Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2復合納米顆粒對HL60細胞相對存活率的影響。結果表明，CS本身對細胞的生長無明顯抑制作用，且在低質量濃度5 μg/mL時對細胞生長還有一定的促進作用；而隨著 TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2、FA-CS@Fe-TiO2離子質量濃度的升高，細胞的相對存活率逐漸降低，即各納米材料對細胞的暗毒性隨其質量濃度的升高逐漸增強。但相對于Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2的暗毒性，CS@Fe-TiO2的暗毒性降低更明顯，細胞的相對存活率整體偏高，即使在160 μg/mL的高質量濃度作用下，與CS@Fe-TiO2（3:2）共孵育的HL60細胞其相對存活率仍可高達85%，另外CS@Fe-TiO2（1:1）和CS@Fe-TiO2（2:1）的相對存活率分別為80%、83%，這表明CS的包裹能改善金屬Fe摻雜帶來的毒副作用，從而顯著提高復合納米顆粒的生物相容性。

2.3 復合納米顆粒對HL60細胞的PDT體外滅活試驗

PDT效率的計算公式：

式中EfficiencyPDT為PDT效率；ODirradiation為光照組的OD值；ODwithout-irradiation為遮光組的OD值。

圖5 暗室條件下經不同納米顆粒作用后HL60細胞的相對存活率Fig. 5 Relative survival rate of HL60 cells in dark room after different nanoparticles（a）不同質量濃度TiO2、Fe-TiO2、CS對HL60細胞的暗毒性分析（P＜0.05）；（b）不同質量濃度CS@Fe-TiO2對HL60細胞的暗毒性分析（P＜0.05）；（c）不同質量濃度FA-CS@Fe-TiO2對HL60細胞的暗毒性分析（P＜0.05）。(a) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS on HL60 cells (P＜0.05)； (b) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of CS@Fe-TiO2 on HL60 cells (P＜0.05)； (c) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of FA-CS@Fe-TiO2 on HL60 cells (P＜0.05).

由圖5b、5c的暗毒性試驗數據可知，HL60細胞與未用FA修飾的CS@Fe-TiO2納米顆粒和FA修飾后的CS@Fe-TiO2納米顆粒共孵育后，后者細胞的相對存活率較前者細胞的相對存活率降低了7%左右。在光照劑量為18 J/cm2、波長為410 nm的光源下進行PDT之后，HL60細胞的相對存活率明顯低于之前的遮光組。如圖6a、6b可知，當光照條件一樣時，同一質量濃度不同納米顆粒作用下的HL60細胞的相對存活率依次為：FA-CS@Fe-TiO2（3:2）＜FACS@Fe-TiO2（2:1）＜FA-CS@Fe-TiO2（1:1）＜CS@Fe-TiO2（3:2）＜CS@Fe-TiO2（2:1）＜CS@Fe-TiO2（1:1）＜Fe-TiO2＜TiO2，且FA-CS@Fe-TiO2作用后的細胞相對存活率較CS@Fe-TiO2作用后的細胞相對存活率降低了19%左右。由此可知FA-CS@Fe-TiO2納米顆粒的暗毒性和光催化過程均能殺傷滅活HL60細胞，而在PDT試驗中FA-CS@Fe-TiO2的靶向光催化滅活占主要地位。由圖6c可知，隨著各納米顆粒質量濃度的升高，其PDT滅活HL60細胞的效率逐漸增強，并且經過Fe摻雜、CS包裹的復合納米顆粒的PDT效率均不同程度地高于純TiO2，說明Fe的摻雜以及CS的包裹可以不同程度地提高TiO2的光催化活性，從而提高PDT的滅活效率。另外在質量濃度大于80 μg/mL后，PDT效率的上升趨勢變緩，這可能是由于納米顆粒的質量濃度偏高，HL60細胞對納米顆粒的吸收已達到飽和，影響了細胞的攝取。此外還可看出，CS@Fe-TiO2（3:2）的整體PDT效率要高于另外2種不同比例的CS@Fe-TiO2納米材料，其PDT效率最高可達55.18%。其原因可能是：適量的CS包裹有利于提高復合納米顆粒的光催化活性；少量的CS包裹使得復合納米顆粒所含氨基、羥基的數量有限，因而光催化效果不佳；而過量的CS會導致復合納米顆粒的凝聚，從而影響其分散性，使得光照射到的面積有限。

由圖6d可知，FA-CS@Fe-TiO2的PDT滅活效率要遠高于TiO2的PDT滅活效率，且隨著粒子質量濃度的升高，FA-CS@Fe-TiO2的PDT滅活效率也逐漸增強。當質量濃度為160 μg/mL時，FA-CS@Fe-TiO2（3:2）納米顆粒的PDT滅活效率達到78.75%，比同質量濃度未用FA修飾的CS@Fe-TiO2（3:2）增加了23.57%，說明FA的修飾能使復合納米顆粒對HL60細胞具有良好的靶向性，能增強其滅活效果。

圖6 不同質量濃度納米顆粒對HL60細胞的活性影響以及PDT滅活效率Fig. 6 Effect of nanoparticles of different concentrations on HL60 cell activity and PDT inactivation efficiency（a）不同質量濃度TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2處理的HL60細胞在光照下的細胞存活率（P＜0.05）；（b）不同質量濃度TiO2、FA-CS@Fe-TiO2處理的HL60細胞在光照下的細胞存活率（P＜0.05）；（c）不同質量濃度TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2對HL60細胞的PDT滅活效率（P＜0.05）；（d）不同質量濃度TiO2、FA-CS@Fe-TiO2對HL60細胞的PDT滅活效率（P＜0.05）。(a) Cell survival rate of HL60 cells treated with different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 under light (P＜0.05)； (b) Cell survival rate of HL60 cells treated with different mass concentrations of TiO2, FA-CS@Fe-TiO2 under light (P＜0.05)； (c) PDT ef ficiency of HL60 cells with different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 (P＜0.05)； (d) PDT ef ficiency of HL60 cells with different mass concentrations of TiO2, FA-CS@Fe-TiO2 (P＜0.05).

2.4 FA-CS@Fe-TiO2納米顆粒PDT體外滅活HL60細胞的機理分析

2.4.1 FS分析

本試驗進一步測試了TiO2、Fe-TiO2和不同質量比的CS@Fe-TiO2納米顆粒的熒光發射光譜，試驗結果如圖7所示。從圖7中可知，TiO2在摻雜Fe、CS之后，其熒光強度出現了明顯的變化。對比單純的TiO2，Fe-TiO2及不同比例的CS@Fe-TiO2的熒光發射強度均有不同程度的降低，且CS@Fe-TiO2（3:2）的熒光強度最低。相關研究表明，半導體顆粒的光致發射光譜是由其內部電子-空穴的復合所引起的，其熒光強弱的變化與在適當波長激發下的顆粒內部載流子電荷的轉化、遷移和捕獲效率相一致，電子-空穴復合率越高則熒光強度越強［21-22］。由此可知，410 nm光照下，Fe、CS與TiO2之間發生了有效的電子轉移，使其空穴電子的復合率明顯降低。其中CS@Fe-TiO2（3:2）的熒光強度減弱程度最大，表明電子-空穴的復合率越低，可參與吸收轉移光子能量的粒子越多、光催化效果越好。

圖7 不同納米顆粒的熒光發射光譜（λex = 410 nm）Fig. 7 Fluorescence emission spectra of different nanoparticles(λex = 410 nm)

2.4.2 FA-CS@Fe-TiO2復合納米顆粒介導的PDT試驗過程中活性氧（ROS）的檢測

在PDT中，活性氧（reactive oxygen species, ROS）是造成細胞損傷、誘導細胞凋亡的主要媒介［23］，因此光照后在細胞內部導致的ROS產量已經成為評價光敏劑性能的一個重要指標。圖8為TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2介導的PDT過程中細胞內ROS的熒光光譜圖。從圖8中可得，ROS（TiO2）＜ROS（Fe-TiO2）＜ROS（CS@Fe-TiO2）＜ROS（FA-CS@Fe-TiO2），顯然摻雜后的TiO2能產生更多的ROS。分析可知，當光輻射到復合納米顆粒表面時，其價帶電子吸收光子的能量躍遷到導帶，因而在價帶中產生空穴。導帶電子和價帶空穴與細胞內的氧分子、水分子分別發生氧化和還原反應，而兩者均能產生大量的活性氧物質，如超氧陰離子自由基（O2·-）、羥基自由基（OH·）等。通過Fe、CS摻雜后，復合納米顆粒中氨基、羥基有效地抑制了其電子-空穴的復合，促進了光催化過程中的氧化還原反應，因而產生了更多的活性氧物質。其氧化反應方程式如下：

此外，經FA修飾后，復合納米顆粒對HL60細胞具有靶向性，因而進入細胞內參與光動力反應的納米顆粒不斷增多，PDT過程中介導產生的ROS含量也不斷增加。

圖8 PDT作用后HL60細胞中ROS探針的熒光光譜（λex = 485 nm）Fig. 8 Fluorescence spectra of ROS probe in HL60 cells after PDT for 485 nm

2.4.3 細胞內攝取納米顆粒的熒光強度分析

如圖9所示，曲線（1）表示細胞內CS@Fe-TiO2所產生的熒光強度，曲線（2）表示細胞內FA-CS@Fe-TiO2所產生的熒光強度。與CS@Fe-TiO2相比，FACS@Fe-TiO2的熒光強度顯著增強，即表明被細胞攝取參與到細胞活化反應的FA-CS@Fe-TiO2納米顆粒遠遠多于CS@Fe-TiO2，說明了FA的修飾可以增強納米顆粒的靶向性，顯著提高細胞對復合納米顆粒的攝取效率，從而提高PDT滅活效率，因此起到了較好的修飾效果。這與前面FA-CS@Fe-TiO2的PDT效率高于CS@Fe-TiO2的PDT效率相一致。

圖9 細胞攝取不同納米顆粒的熒光光譜Fig. 9 Fluorescence spectrum of cells taking up different nanoparticles

3 討論

本文主要研究了TiO2改性后形成的復合納米顆粒FA-CS@Fe-TiO2對HL60細胞的PDT滅活作用。采用溶膠凝膠法、離子交聯法、表面修飾等方法制備了FA-CS@Fe-TiO2復合納米顆粒。SEM圖像表明Fe的摻雜能有效提高納米顆粒的分散性。紫外-可見光譜表明，Fe摻雜后納米顆粒的吸收邊明顯紅移。通過傅里葉紅外光譜圖對不同納米顆粒所含基團的振動吸收峰進行對比可知，FA與CS@Fe-TiO2已連接成功，使得復合納米顆粒對HL60細胞具有良好的靶向性，有效地提高了FA-CS@Fe-TiO2的PDT體外滅活HL60細胞的效率。細胞試驗表明，暗室條件下TiO2、Fe-TiO2均有較低的毒性，而低質量濃度的CS能促進HL60細胞的生長，可能是因為低質量濃度的CS能夠在生物體內降解。此外Fe-TiO2被CS包裹后也具有較好的生物相容性。在PDT中，當光照射光敏劑時，光敏劑能吸收光子的能量從基態躍遷到激發態，隨后將吸收的能量轉移到附近的氧氣分子上產生單線態氧，或者與周圍的物質通過電子轉移發生光化學反應產生活性氧物質［24-25］。活性氧物質能與細胞生物膜、各種亞細胞器以及細胞內大分子（例如蛋白質、核酸等）發生反應，加快機體衰老，誘導細胞壞死或凋亡。本文的PDT試驗結果顯示，FA-CS@Fe-TiO2整體的PDT滅活效率遠遠高于TiO2、CS@Fe-TiO2，且隨著納米粒子質量濃度的升高，FA-CS@Fe-TiO2的PDT滅活效率也逐漸增強。當質量濃度為160 μg/mL時，FA-CS@Fe-TiO2（3:2）納米顆粒的PDT滅活效率達到78.75%，比同質量濃度未用FA修飾的CS@Fe-TiO2（3:2）增加了23.57%，比同質量濃度的TiO2增加了54.75%。分析其原因可知：Fe和CS的摻雜能有效地抑制TiO2中電子和空穴的復合，從而提高復合納米顆粒的光催化活性，在PDT過程中產生更多的活性氧物質。而FA的修飾增強了復合納米顆粒與HL60細胞的特異性結合，進一步提高了FA-CS@Fe-TiO2對HL60細胞的滅活效率。因此，FA-CS@Fe-TiO2有望成為一種用于靶向治療腫瘤細胞的新型光敏劑。