腦出血后繼發性神經損傷發生過程中microRNAs調控作用機制的研究進展

曹洪濤，鄒偉，于學平

1黑龍江中醫藥大學，哈爾濱150040；2黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院神經內科

腦出血后繼發性神經損傷是腦出血后常見的并發癥之一，腦出血幸存者中，約有75%患者伴有繼發性神經損傷，出現不同程度的運動、感覺、語言等繼發性神經功能障礙［1-2］。腦出血后繼發性神經損傷的發病機制復雜，多與腦出血發病早期血腫占位效應和潛在血腫擴張等原發性腦損傷及血腦屏障破壞、炎癥、細胞凋亡、氧化應激等繼發性腦損傷有關。

miRNAs是神經系統疾病發展中神經損傷的重要轉錄和轉錄后調節因子，其通過與多個靶標mRNA的3'非翻譯區（UTR）結合，負向調節靶基因的表達，通過特定的RNA降解或整合來調節細胞的生理過程（包括細胞增殖、分化、凋亡、代謝等）［3-5］。近年研究發現，外源性microRNAs（miR?NAs）可幫助患者減輕腦出血后繼發性神經損傷，減輕神經功能障礙程度［5］。深入研究miRNAs在腦出血后繼發性神經損傷發生過程中的調控機制有助于該病的早期診斷及治療，早日改善臨床神經功能缺損癥狀。文獻報道顯示，miRNAs在腦出血后繼發性神經損傷發生過程中，具有維護血腦屏障完整性、減輕炎癥、減少細胞凋亡及抗氧化應激等作用［2］。現就miRNAs的上述調控機制的研究進展綜述如下。

1 保護血腦屏障

血腦屏障是血液和大腦之間的物理和生理屏障，可防止神經毒性血漿成分、血細胞及病原體進入大腦，是一種多細胞神經血管復合體。其完整性主要由腦內皮細胞（血腦屏障的基本單位）決定，腦內皮細胞之間緊密連接的改變和這些細胞的胞吞作用對血腦屏障的完整性有顯著影響［6］。此外，內皮細胞和形成神經血管單元的支持細胞（如星形膠質細胞、免疫細胞、血管周細胞和大腦中的其他細胞）之間的相互作用也有助于維持血腦屏障的完整性［7］。miRNAs通過多種途徑參與調節血腦屏障，但大多數miRNAs通過靶向腦內皮細胞、內皮連接分子，直接或間接影響血腦屏障的緊密連接，參與血腦屏障完整性的改變［8］。miRNAs作為表觀基因修飾的重要組成部分，在腦出血后因血腦屏障損傷繼而導致神經損傷的發生過程中起重要的調控作用。

1.1 miR-126-3p miR-126-3p是一種與血管完整性、血管生成和血管炎癥有關的微小RNA，miR-126-3p在腦出血患者受損腦組織中表達水平較低且向血液中的釋放含量明顯減少［9-10］。miR-126-3p能夠通過下調出血區域血管細胞黏附因子-1，增加內皮細胞中血管內皮生長因子A的水平和降低Cas?pase-3的水平，減輕顱內出血誘導的血腦屏障破壞［9］。miRNAs在維持血管生理結構的完整性和內皮細胞的正常屏障功能方面起重要作用。通過調節血腦屏障結構的滲透性，減少有害物質向血液中的釋放水平，減輕顱內出血對血腦屏障的破壞，減少發生神經損傷概率［11］。

1.2 miR-27a-3p miR-27a-3p是一種與內皮細胞高度相關的miRNAs，在內皮細胞中高度表達，屬于腦出血患者血清中下調miRNA之一，同時在腦出血大鼠模型的血腫周圍、血腫塊和血清中均顯著下降；具有保護血腦屏障，減輕神經損傷的潛在功能［10，12］。在動物實驗中，miR-27a-3p可通過靶向內皮水通道蛋白11保護血腦屏障；同時可減少與血腫相鄰的垂死神經元的數量，降低血腫周圍組織的凋亡率，防止腦出血后血腦屏障破壞，進而減輕繼發性神經損傷［13］。

2 抑制炎癥反應

炎癥是一種復雜的損傷后免疫反應，尤其是神經炎癥更成為影響腦出血預后的關鍵因素。在正常情況下，炎癥有助于清除壞死細胞或組織，并啟動組織修復過程；然而，過度激活免疫反應會對機體造成嚴重損害。小膠質細胞被認為是腦出血后最先做出反應的炎性免疫細胞，激活的小膠質細胞，可以動態和暫時改變其表型，從而分化成兩種表型，M1（釋放促炎因子，加重炎性反應，如IL-1β、TNF-α等）和M2（幫助機體吞噬血腫，其釋放的抗炎因子，對抗炎癥反應，如IL-10、TGF-β等）；與此同時，腦出血會觸發炎癥因子及生物活性因子的釋放，如IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α等，并通過細胞形態及生理變化繼而造成腦出血后的炎癥反應的發生與發展，損傷神經功能［14］。miRNA能夠靶向參與調控炎癥反應及小膠質細胞極化，在腦出血后具有抗炎作用，減輕神經損傷。

2.1 miR-223 miR-223是miRNA家族的重要成員之一，于2003年由定量聚合酶鏈反應首次鑒定［15］。它的基因位于人類、老鼠和牛的X染色體上。miR-223可以結合特定的靶基因來抑制各類細胞（如粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）中的促炎細胞因子或炎癥信號，調節促炎或抗炎巨噬細胞極化，促進中樞神經系統髓鞘再生［16］。miR-223已被證明是腦出血后小膠質細胞激活，炎癥和神經元損傷的重要調節劑［17］。在腦出血 動物模型中，miR-223通過IL-1β與caspase-1，促進NLRP3下調，進而調控炎癥反應，減輕腦水腫及神經功能缺損癥狀［18］。

2.2 miR-21 miR-21參與脂多糖誘導的巨噬細胞促炎特性，其過表達可有效促進促炎細胞因子上調，將細胞推向促炎表型，在炎性免疫反應到其消退的轉變中發揮重要作用［19-21］。在腦出血動物模型中，miR-21可以調節Akt和（或）ERK/MAPK通路，及負調節Toll樣4受體的表達來減輕炎癥反應［22-23］。此外，miR-21的過表達可以減輕NF-κB途徑的激活（NF-κB［24］是一種轉錄因子，能夠誘導促炎基因的的表達，調節先天免疫細胞和炎性T細胞的存活、活化和分化，介導炎性反應，是與炎癥有關的中心通路），通過外泌體從間充質干細胞運到神經元，促進間充質干細胞的成活率，有效降低了間充質干細胞的凋亡率和凋亡相關蛋白表達，減輕神經損傷［25］。

2.3 miR-146a miR-146a是位于5號染色體長臂上的miR-146家族成員，對中樞神經系統疾病中起關鍵作用，在腦出血患者血清中表達水平較低。miR-146a的過表達能夠降低腦出血后炎癥介質（如IL-1β、IL-6、IL-8）和生物活性因子的釋放，能夠負向調節腦出血后誘導的小膠質細胞炎性反應并減少腦出血后的細胞死亡，具有預防腦損傷及繼發性神經損傷的作用［26］。YUAN等［27］研究證明，miR-146a可通過靶向白介素1受體相關激酶1和TNF受體相關因子6（TRAF6）的3'UTR，抑制NF-κB通路，降低腦出血大鼠促炎性細胞因子（MMP-9，TNF-α和IL-1β）的產生，可有效預防炎性細胞浸潤造成的神經損傷。

2.4 miR-155 miR-155由位于21號染色體上的B細胞整合基因編碼，廣泛存在于中樞神經系統，是一種關鍵的促炎miRNA，在炎性疾病中具有重要作用［28］。同時，在中樞系統疾病中，敲除miR-155能夠提高神經元的內在生長能力、促進軸突生長和可塑性［29］。在腦出血大鼠模型急性發作期，大鼠頂葉皮層部miR-155表達水平及IL-1β、IL-6和TNF-α含量均升高；經側腦室注入miR-155抑制劑后，IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子水平均降低，改良的神經嚴重程度評分也隨之降低，表明miR-155信號參與腦出血后繼發性神經損傷過程，阻斷miR-155通路能夠通過減少促炎因子釋放，降低神經功能損傷程度，進而改善大鼠腦出血后神經功能缺損癥狀［30］。

3 減少細胞凋亡

細胞凋亡是一種以能量依賴和程序性細胞死亡為特征的細胞死亡，被認為是導致腦出血后細胞損傷的主要機制。它通過清除老化或受損細胞維持止血機制，并且通過去除有缺陷的和過度的細胞調節免疫系統［31］。簡而言之，細胞凋亡的過程，最初由內在或外在途徑觸發。內源性途徑與線粒體信號傳導途徑相關；外源性途徑是通過細胞表面死亡受體，包括腫瘤壞死因子TNF-α以及TNF相關的凋亡誘導配體受體活化進行的［32-33］。腦卒中后誘導大量Ca2+流入細胞，導致線粒體細胞色素c（Cytc）或凋亡誘導因子釋放［34］。釋放的Cytc與凋亡蛋白酶激活因子1和procaspase-9結合形成凋亡體，激活caspase-9及caspase-3，導致nDNA損傷并最終導致細胞死亡，損傷神經功能，繼而出現如肢體偏癱、麻木等一系列神經功能缺損癥狀。據報道，miRNA的表達可以通過調節靶基因的水平、旁分泌信號傳導，介導血管生成和保護神經活性，調節腦卒中后神經元存活，預防神經損傷，發揮神經保護作用［35-37］。

3.1 miR-132 miR-132是中樞神經系統中含量最多的miRNA之一。通過其靶基因甲基CpG結合蛋白2和Rho GTPase激活劑p250GAP調節樹突形態和突觸功能，在神經發育和神經元活動的調節中起關鍵作用［38］。miR-132的過表達，能夠顯著下調腦組織中Bax、Cytc和caspase-9的表達，上調BCl-2的表達，并降低Caspase-3活性，抑制細胞凋亡［39］。在靶向蛋白方面，miR-132能夠靶向SIRT1 3'UTR（一種組蛋白脫乙酰酶）并降低其活性，從而導致p53（一種凋亡誘導劑）乙酰化增加，最終導致Puma和Noxa等其他促凋亡基因的過度表達，最終導致細胞死亡［40］。現有研究表明，促進miR-132過表達能夠減少腦出血小鼠細胞凋亡，減輕腦出血后繼發性神經損傷，降低小鼠患神經功能障礙的概率［41］。

3.2 miR-181c miR-181c在中樞神經系統中皮質區域廣泛表達［42］，其表達動態變化可能與特定的神經發育階段有關，能夠控制發育中的皮質神經元中神經突和樹突棘的生長［43-44］。miR-181c通過直接靶向調節TNF-α，最終誘導細胞凋亡［45］。在腦出血大鼠模型中，miR-181c通過靶向PTENPI3K/Akt通路及Bcl-2/Bax比值直接介導和調節細胞凋亡，且其表達水平的高低與神經嚴重程度評分高度相關，表明miR-181c可通過調節神經細胞凋亡，在腦出血后發揮保護神經作用，減輕神經損傷［46］。

4 抗氧化應激

氧化應激主要由促氧化劑（ROS/RNS）的過度平衡和（或）細胞中抗氧化系統的缺乏引起。腦出血期間自由基和ROS的形成涉及多種機制，包括對N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受體的高刺激、Ca2+超載、線粒體功能障礙和神經元一氧化氮合酶激活［31］。氧化損傷是腦出血后腦損傷進而導致神經損傷的基本機制。氧化應激狀態時，相當于大腦所處環境具有高度氧化的特性、低水平的抗氧化劑含量和極高的鐵含量，此時大腦的神經功能極易受損［47］。目前廣泛研究出可維持大腦氧化還原穩態的幾種抗氧化酶和解毒酶包括谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽S-轉移酶。與此同時，Nrf2作為重要的氧化和異生物質應激反應的主轉錄因子，成為抗氧化反應的關鍵組成部分，減輕腦出血后繼發性神經損傷，保護神經功能［48］。在miRNAs家族中，有85種miRNA可 以 調 節Nrf2 mRNA的 水 平［49］。XU等［50］表 明，miR-27b可以直接靶向Nrf2 mRNA來調節Nrf2表達，抑制miR-27b能夠減輕腦出血后腦損傷，并通過Nrf2/ARE通路上調腦出血后Nrf2、Hmox1、SOD1和Nqo1的表達，減輕神經損傷，避免發生神經功能缺損。該基因可能是治療腦出血后繼發性神經損傷的潛在治療靶點。但截至目前miRNAs在腦出血后繼發性神經損傷中的抗氧化作用的研究較少，應進一步探索miRNAs在腦出血后繼發性神經損傷中抗氧化應激方面的作用。

綜上所述，miRNAs通過參與腦出血的病理過程發揮作用，是調節腦出血后繼發性神經損傷的重要環節，為干預腦出血后繼發性神經損傷提供了多重靶點。雖然目前有關miRANs治療腦出血后繼發性神經損傷的研究仍處于初級階段，且多數研究僅限于動物實驗，臨床研究仍處于較低水平；但基于miRNAs減輕腦出血后繼發性神經損傷的作用機制及其多重作用，進一步探討腦出血患者miRNAs的表達變化、探尋腦出血后繼發性神經損傷的相關miRNAs分子靶點及其作用機制、以及如何安全有效地利用miRNAs防治腦出血后繼發性神經損傷具有長遠的臨床意義。