啤酒酵母釀造葡萄酒及香氣成分GC-MS分析研究

劉永衡，陳 彬，王學英

（寧夏工商職業技術學院能源化工學院，寧夏銀川 750021）

香氣是葡萄酒品質的一項重要指標，其產生主要來自于釀酒葡萄品種、酵母以及工藝等因素的綜合作用下，世界著名產地的葡萄酒都有著自己獨特的香氣特征。酵母作為賦予葡萄酒香氣特征的主要因素之一，不同酵母發酵產生的代謝產物很大程度影響著葡萄酒感官特征以及消費者喜好[1]。酵母菌的主要作用是催化糖類轉化為酒精，但除了酒精之外，酵母菌對最終的產品品質也有著貢獻，例如香氣成分[2]。大量研究表明，酵母及其他微生物在葡萄酒香氣產生中的作用毋庸置疑[3-5]。酵母菌主要以兩種方式影響葡萄酒的香氣成分：一種是從頭產生香氣成分，另一種是通過修飾來自于葡萄的某些前體化合物產生[6]。選擇合適的釀酒酵母對于葡萄酒發酵非常重要，合適的酵母可以為葡萄酒帶來更加優異的風味表現。

啤酒酵母除用于釀造啤酒、酒精及其他的飲料酒外，還可發酵面包[7]。啤酒酵母按照發酵狀態可分為上層酵母（又稱為艾爾酵母）和下層酵母（又稱為拉格酵母）。目前國內外尚無有關于啤酒酵母釀造葡萄酒的報道，利用啤酒酵母釀造果酒的報道僅見于張寶善等[8]利用啤酒酵母釀造石榴果酒的工藝研究。本研究中采用的弗曼迪斯清香高沉淀型拉格啤酒酵母S-189，其屬于下層酵母，具有發酵活力高、耐低溫的特點。利用啤酒酵母S-189單發酵、葡萄酒酵母單發酵以及S-189、葡萄酒酵母混菌發酵葡萄酒，采用頂空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其香氣成分差異，旨在為啤酒酵母、混菌釀造葡萄酒提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑比諾葡萄、梅鹿輒葡萄：寧夏西夏王葡萄酒業（集團）有限公司；S-189啤酒酵母：寧夏工商職業技術學院能源化工學院微生物實驗室保存；葡萄酒酵母F1：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

乙酸乙酯（色譜純）：美國Fisher公司；2-辛醇標準品（純度＞99.5%）：美國Sigma公司；無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；焦亞硫酸氫鉀（分析純）：上海羅恩試劑公司；EX-V果膠酶：法國拉曼公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司；頂空固相微萃取纖維頭DVB/CA/PDMS（2 cm，50/30 μm）：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝流程

操作要點：采用黑比諾葡萄、梅鹿輒葡萄（1∶1比例）為釀酒原料，除梗破碎后加入焦亞硫酸氫鉀60 mg/L，果膠酶20 mg/L，浸漬24 h后加入活化酵母（S-189啤酒酵母用5%蔗糖水在25 ℃活化2 h，F1葡萄酒酵母用5%蔗糖水在37 ℃活化30 min），發酵方式為啤酒酵母S-189單獨發酵（SY）（發酵溫度為10 ℃）、葡萄酒酵母F1單獨發酵（AY）（發酵溫度為20 ℃）和混菌發酵（MY）（酵母S-189和F1 1∶1比例添加[9]，發酵溫度為10 ℃），酵母添加后每隔6 h測一次溫度及比重，待比重降到0.992～0.996時并維持不變后即為主發酵結束，隨后進行皮渣分離，原酒分離后采用自然發酵的方式進行蘋果酸-乳酸發酵，結束后添加焦亞硫酸氫鉀60 mg/L，倒罐降溫冷藏澄清，過濾機過濾，得到葡萄酒貯存備用。

1.3.2 GC-MS分析條件

（1）葡萄酒樣前處理

采用頂空固相微萃取（HS-SPME）方法進行前處理，取葡萄酒樣5 mL于15 mL頂空瓶中，加入1 g氯化鈉、5 μL內標物2-辛醇（稀釋比例1∶200）和磁力轉子后迅速擰緊瓶蓋，將萃取頭插入樣品頂空瓶，置于磁力攪拌器于60 ℃吸附30 min。吸附后將萃取頭取出插入氣相色譜進樣口，于200 ℃解吸5 min，進樣量1 μL[10]。

（2）葡萄酒樣GC-MS檢測條件

氣相色譜條件：色譜柱為HP-INNO-Wax毛細管柱（30.0m×0.25 mm×0.25 μm），載氣氦氣（He）（純度99.99%），流速1.10 mL/min；進樣口溫度200 ℃；升溫程序：35 ℃保持3 min，以4 ℃/min的升溫速度升至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的升溫速度升至230 ℃。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，傳輸線溫度250 ℃，電子能量70 eV，光電倍增管電壓350 V，質量掃描范圍30～350 amu。

定性方法：由GC-MS分析得到的質譜數據經計算機在美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）17標準譜庫檢索及WILEY質譜圖庫比對，譜庫比對時要求匹配度＞700，定性鑒定出大部分峰。

定量方法：葡萄酒樣采用內標法進行半定量分析，內標為2-辛醇；待測香氣成分定量分析計算公式為：香氣組分的含量（μg/L）=[（各組分的峰面積/內標峰面積）×內標質量（μg）]/樣品體積（L）。

1.3.3 香氣活力值分析

氣味活力值（odor activity value，OAV）是評價香氣成分對飲料、酒以及其他食品物質香氣的貢獻指標，樣品中OAV＞1的香氣成分是樣品香氣特征的主要來源。OAV=香氣物質濃度/香氣物質閾值，根據文獻[11-13]查找每個香氣物質在葡萄酒中的閾值，計算各個香氣成分的OAV，并統計OAV＞1的香氣物質，表征各個香氣物質對葡萄酒樣品香氣貢獻的大小。

1.3.4 分析檢測

（1）感官指標

參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]以及李華《葡萄酒品嘗學》[12]，由8名專業人員從外觀（10分）、香氣強弱（30分）及滋味（40分）、典型性（20分）四個方面綜合評價，滿分100分，每個樣品隨機編號盲品3次求平均值。

（2）理化指標

酒精度、總酸度、還原糖、總SO2含量檢測參照國標GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，其中酒精度采用酒精計法；總酸度采用酸堿滴定指示劑法，結果以酒石酸計；還原糖采用直接滴定法，結果以葡萄糖計；總SO2采用直接碘量法，結果以游離SO2（mg/L）計；單寧參照李華[15]《葡萄酒分析檢驗》中的福林-丹尼斯法。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒感官指標分析

如圖1所示，AY葡萄酒在外觀評定上的得分最高，其次為MY葡萄酒，SY葡萄酒最低；香氣、滋味、典型性等項目得分順序均表現為MY葡萄酒＞SY葡萄酒＞AY葡萄酒；最終綜合評定表示MY葡萄酒風味最佳，SY葡萄酒風味其次，以啤酒酵母或混菌釀造葡萄酒風味較為獨特。

圖1 SY、AY、MY發酵方式釀造葡萄酒感官評價Fig.1 Sensory evaluation of wines produced by SY,AY and MY fermentation mode

2.2 葡萄酒基本理化指標分析

釀造葡萄酒儲存40 d后，取3種葡萄酒進行理化指標檢測，結果見表1。由表1可知，SY、AY、MY葡萄酒的理化指標均滿足國標GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求，并且MY葡萄酒的理化指標優于SY、AY葡萄酒。

表1 SY、AY、MY發酵方式釀造葡萄酒酒樣基本理化指標Table 1 Basic physical and chemical indexes of wines produced by SY,AY and MY fermentation mode

2.3 葡萄酒樣GC-MS檢測結果分析

葡萄酒樣SY、AY及MY中香氣成分的GC-MS總離子流譜圖見圖1，經標準譜庫檢索比對，葡萄酒樣SY、AY及MY中各組分鑒定分析結果分別見表2。

圖2 SY（A）、AY（B）及MY（C）發酵方式釀造葡萄酒樣香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components in wines produced by SY (A),AY (B) and MY (C) fermentation mode analysis by GC-MS

表2 3種葡萄酒樣香氣成分GC-MS分析結果Table 2 Aroma components in 3 kinds of wines analysis by GC-MS

續表

由圖2、表2可知，3種葡萄酒樣品共檢出34種揮發性香氣成分，SY葡萄酒樣GC-MS分析檢測總共鑒定出15個化合物，其中醇類化合物總計6種，含量最高的為3-甲基-1-丁醇（4 906.83 μg/L）；酯類化合物總計9種，含量最高的為山梨酸甲酯（1 419.38 μg/L）；AY葡萄酒樣GC-MS分析檢測總共鑒定出20個化合物，其中醇類化合物總計6種，含量最高的為3-甲基-1-丁醇（6 030.48 μg/L）；酯類化合物總計5種，含量最高的為乙酸苯乙酯（833.28 μg/L）；有機酸類總計4種，含量最高的為辛酸（2 607.05 μg/L）；此外還鑒定出2-庚酮、苯甲醛、β-紫羅蘭酮、丁子香酚、胡椒醛等其他5種化合物；MY葡萄酒樣GC-MS分析檢測中總共鑒定出22個化合物，其中醇類化合物總計5種，含量最高的為3-甲基-1-丁醇（18 590.83 μg/L）；酯類化合物總計12種，含量最高的為2,4-己二烯酸乙酯（1 711.98 μg/L）；有機酸類總計4種，含量最高的為辛酸（1 439.61 μg/L）；此外也鑒定出化合物胡椒醛。SY和MY兩種葡萄酒中醇類化合物含量所占比例均最高，其次為酯類化合物；AY中醇類化合物含量所占比例最高，其次為有機酸類化合物，最后為酯類化合物。

2.2 葡萄酒樣OAV分析

由表3可知，三個樣品中總計有6種特征香氣組分（OAV＞1），其中包括5種酯類化合物和1種有機酸化合物；SY、AY、MY樣品中OAV＞1的香氣化合物分別有3、3、4種，SY樣品特征香氣組分全部為酯類，其中OAV最大的香氣組分為辛酸乙酯；AY、MY樣品特征香氣組分除了酯類還有有機酸，其中OAV最大的香氣組分都為己酸乙酯。

表3 三種葡萄酒樣OAV值大于1的香氣物質Table 3 Volatile compounds (OAV＞1) in 3 kinds of wines

3 討論

本研究表明采用兩種酵母混菌發酵相對于酵母單發酵葡萄酒香氣物質種類有所增加，三個葡萄酒樣品含量最高的化合物均為異戊醇；這與他人的研究成果一致，例如趙現華等[16]研究了共發酵對蛇龍珠葡萄酒香氣成分的影響，最終共檢出39種揮發性成分，其中異戊醇含量最高；且兩種酵母共發酵相比較于單酵母發酵香氣成分、含量都有所增加。胡雪蓮等[17]研究了四株啤酒酵母的釀造特性以及其釀造的啤酒中的風味物質，發現在四種啤酒中醇類風味物質含量最高的都是異戊醇。然而，從香氣成分種類數量來看，相對于已報道的其他葡萄酒香氣成分，三個樣品香氣成分種類明顯較少。例如姚瑤等[18]從4個產區的赤霞珠干紅葡萄酒鑒定出91種香氣成分，4個樣品分別鑒定出29種、30種、49種、50種香氣成分。余歡等[19]利用不同的7株酵母釀造葡萄酒，GC-MS共檢測到68種香氣成分，其中每個樣品檢測到50種左右香氣成分；馮濤等[20]葡萄園土壤中分離到4株釀酒酵母并分別用于發酵葡萄酒，從釀造的4種葡萄酒共檢測到45種香氣成分，其中每個樣品檢測到35種左右香氣成分；三個樣品中檢測出的香氣成分較少的原因極大程度上可能與發酵溫度較低有關，SY、MY樣品發酵溫度為10 ℃，而AY樣品為20 ℃，發酵溫度均低于上述文獻中的葡萄酒。另外，SY樣品未檢測到揮發酸，揮發酸是葡萄酒香氣成分中經常能夠檢測到的成分，例如乙酸、己酸等，對于葡萄酒香氣風味有一定的影響[21]，推測SY樣品未檢測到揮發酸可能是采用啤酒酵母、酸類成分含量太低等原因。有些酵母菌（特別是德爾布魯克氏酵母，一種啤酒酵母）在發酵過程中產生的酸類會明顯減少[22]，這也可能是SY樣品風味相對于AY、MY樣品較為獨特的原因，OAV分析也顯示，AY、MY樣品香氣特征除了酯類的香氣貢獻外還有有機酸類的貢獻；近年來，人們對混菌發酵越來越關注，大量的研究表明，混菌發酵可以產生更多的香氣，尤其是構成酒體香氣主要成分的酯類[23-26]；混菌發酵可以是兩種釀酒酵母，也可以是一種非釀酒酵母和一種釀酒酵母混合發酵，這種共培養可以引起香氣特征的改變，以及相對較低的乙醇含量[27-28]。本實驗的研究成果與上述研究較一致，相對于SY、AY樣品，MY混菌發酵樣品中的酯類香氣成分從種類到含量都有所增加，OAV進一步分析也明顯可以看出，MY樣品OAV＞1相對較多且數值較大，尤其是酯類成分，也進一步說明酯類成分是葡萄酒香氣特征的主要貢獻來源。

4 結論

綜上所述，為探究啤酒酵母釀造葡萄酒的可行性，本研究從感官、理化、香氣成分以及OAV分析等方面對啤酒酵母釀造葡萄酒的整體質量進行了分析。試驗結果表明：啤酒酵母釀造的葡萄酒SY、MY樣品基本理化指標符合相關國標，表明啤酒酵母S-189可以用于釀造風味獨特葡萄酒，SY、MY葡萄酒感官綜合評定均優于AY葡萄酒，且混菌發酵有助于提升葡萄酒風味，但其變化規律仍需進一步研究。本實驗為啤酒酵母S-189混菌發酵釀造葡萄酒的研究提供了一定的科學依據。