lncRNAPCGEM1在早期原發性肝細胞癌外周血中的表達及臨床意義

何勇勇，方長英，李 萍，張青松，朱傳衛

(1.宣城職業技術學院內科教研室，安徽 宣城 242000；2.宣城市中心醫院檢驗科，安徽 宣城 242000)

肝癌發病率位居世界第6，也是死亡率位居第4的癌癥，其中肝細胞癌占所有肝癌病例的75%～85%[1]。肝細胞癌惡性程度較高，早診斷早治療是提高生存率關鍵所在，積極尋找有效的血清分子標志物對早期肝癌進行篩查和預后評估是一條重要途徑。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究表明lncRNAs在肝癌的發生和發展中起著重要作用，可以作為分子標志物用于肝癌診斷和預后判斷[2-3]。前列腺癌基因表達標記物1(prostate cancer gene expression marker 1，PCGEM1)是最早在前列腺癌中發現有促進細胞增殖功能的lncRNA[4]，研究發現PCGRM1可充當某些microRNA(例如miR-145和miR-148a)的競爭性內源RNA，在前列腺細胞中發揮致癌作用[5-6]。本研究探討PCGEM1在早期原發性肝細胞癌患者外周血中的表達及其對診斷和預后的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年3月—2019年12月在宣城市中心醫院普外科接受肝癌切除術治療的70例原發性肝細胞癌早期患者作為研究對象，其中男性62例，女性8例；年齡31～71歲，平均(49.04±9.26)歲。納入標準：(1)術前未做任何治療的初診患者；(2)2位病理科醫生確診為肝細胞癌。排除標準：患者伴有嚴重心肺疾病、肝炎、肝硬化、高血壓、腦出血、嚴重糖尿病和其他惡性腫瘤等疾病。另外選擇同期體檢的70名健康成年志愿者作為對照組，其中男性61例，女性9例；年齡25～68歲，平均(49.40±8.86)歲。肝癌患者和志愿者在身高、體重、性別、年齡和生活方式等一般資料差異無統計學意義(P＜0.05)。本研究獲得宣城市中心醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集 在肝癌患者術前3 d和術后6 d采集15 mL血液，在志愿者體檢時采集15 mL血液。血液樣本采集后即刻5 000 r/min離心5 min，取上清移至無酶EP管中進行RNA提取和cDNA合成。

1.2.2 RNA提取和cDNA合成 取250 μL血清和750 μL TRIzol(Invitrogen公司)加入無酶EP離心管中，混勻后加入氯仿，振蕩后冰上靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清移至無酶EP離心管中，隨后加入等量異丙醇冰上放置15 min后12 000 r/min離心，棄去上液，加入1 mL 75%乙醇，12 000 r/min離心15 min，洗滌后用適量無酶ddH2O溶解RNA，分光光度計測量RNA濃度為670 ng/μL，OD260/280為 1.96。采用 PrimeScriptTMRT reagent kit(Invitrogen公司)將提取的RNA逆轉錄成cDNA，反應體系為20 μL：1 μL模板RNA，4 μL 5×PrimeScript緩沖液混合物，1 μL PrimeScript RT酶，1 μL oligo dT引物和 13 μL 無 RNase 的ddH2O；反應條件：37℃30 min，85℃5 s，然后4℃孵育60 min，cDNA置-20℃冰箱保存。

1.2.3 qRT-PCR檢測外周血中PCGEM1表達 依據GenBank數據庫中提供的PCGEM1和內參GAPDH序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物序列并交由上海吉瑪生物科技公司合成，PCGEM1上游引物：5′-TGCCTCAGCCTCCCAATA AC-3′，下游引物：5′-GGCCAAAATAAAACCAA ACAT-3′；內參GAPDH上游引物：5′-CAGGAGG CATTGCTGATGAT-3′，下游引物：5′-GAAGGCT GGGGCTCATTT-3′。按照Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen公司)說明書使用7500熒光定量PCR儀(ABI公司)對PCGEM1進行擴增；反應體系20 μL，擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環，實驗重復3次。用2-ΔΔCT方法計算早期肝細胞癌患者和健康體檢者血液中PCGEM1表達量。

1.3 統計學分析

采用SPSS19.0軟件處理實驗數據，符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較使用t檢驗，采用受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析PCGEM1在血液中的表達對肝癌早期診斷和Edmondson-Steiner分級預測的價值，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCGEM1在早期肝癌患者血清中的表達

肝癌患者術前血清中PCGEM1的表達量高于健康對照組和術后患者(均P＜0.001)；而肝癌患者術后和健康對照組血清中PCGEM1的表達差異無統計學意義(t=0.079，P=0.937)。見表1。結果表明早期肝癌患者血清中PCGEM1表達量高于健康人群，肝癌切除術后其表達量下降至正常水平。

表1 PCGEM1在各組中的相對表達量 (n=70，±s)

表1 PCGEM1在各組中的相對表達量 (n=70，±s)

1)：與對照組相比，P＜0.001；2)：與肝癌術后組相比，P＜0.001。

組別對照組肝癌組(術前)肝癌組(術后)PCGEM1表達量1.880±0.793 3.231±0.9421)2)1.871±0.528

2.2 血清中PCGEM1對早期肝癌的診斷價值

ROC分析結果顯示PCGEM1診斷早期肝癌的曲線下面積為0.865(95%CI： 0.802～0.928，P＜0.001)，最優截斷值為2.685，其敏感性和特異性分別為71.4%和91.4%，見圖1。

圖1 PCGEM1診斷早期肝癌的ROC曲線

2.3 血清中PCGEM1對肝癌細胞分級的預測

ROC分析結果表明PCGEM1預測肝癌細胞Edmondson-Steiner分級的曲線下面積為0.903(95%CI： 0.820～0.985，P＜0.001)，最優截斷值為3.115，其敏感性和特異性為97.4%和77.4%，見圖2。

圖2 PCGEM1預測肝癌細胞Edmondson-Steiner分級的ROC曲線

2.4 血清中PCGEM1表達與肝癌臨床病理特征間的關系

腫瘤直徑＞5 cm、無腫瘤包膜和Edmondson-Steiner分級差(Ⅲ級和Ⅳ級)的早期肝癌患者的PCGEM1表達量升高，差異均有統計學意義(均P＜0.05)，見表2。

表2 PCGEM1表達與早期肝癌病理特征的關系

3 討論

本研究顯示早期肝癌患者外周血液中PCGEM1的表達升高且與腫瘤大小、包膜有無和肝細胞癌Edmondson-Steiner分級相關；ROC分析結果顯示外周血中PCGEM1的表達用于診斷早期肝癌的敏感性和特異性分別為71.4%和91.4%；血液中PCGEM1相對表達值＞3.115的患者肝癌細胞分化差，預示腫瘤惡性度高，其敏感性和特異性為97.4%和77.4%。此外，有研究證實PCGEM1過表達與患者預后密切相關，Zhang等[7]的研究表明宮頸癌患者腫瘤組織中PCGEM1過表達與FIGO晚期、淋巴結轉移、遠處轉移及較差的總體生存率相關，PCGEM1促進宮頸癌細胞增殖、細胞周期進程、遷移和侵襲，同時抑制宮頸癌細胞凋亡。上述研究結果均證實了PCGEM1具有癌基因的特征。近年來，越來越多的證據表明lncRNAs可通過競爭性結合microRNA形成競爭性內源RNA，在細胞生物學功能中發揮重要作用[8]，研究顯示PCGEM1與miR-182結合形成競爭性內源RNA，上調FBXW11的表達[7]，FBXW11屬于F-box蛋白家族的FBXW亞家族，可通過調節底物磷酸化和泛素化在各種信號傳導途徑中起關鍵作用[9]，例如：FBXW11通過激活NF-κB信號通路促進黑素瘤、腸癌和皮膚癌等惡性腫瘤的進展[10-11]。此外，FBXW11可通過激活NF-κB和β-catenin/TCF信號通路誘導淋巴細胞白血病的細胞周期進程和腫瘤形成[12]，PCGEM1在肝癌細胞中的作用機制是否與上述信號通路有關還需進一步研究。但可以明確PCGEM1可通過多種途徑促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，致使患者易出現淋巴結轉移和遠處臟器轉移，從而復發率升高，生存率下降。

本研究發現患者外周血中PCGEM1過表達對肝癌早期診斷具有較好的臨床價值。血液樣本易獲得，lncRNAs檢測較為簡單，通過檢測外周血lncRNA PCGEM1的表達對早期肝癌進行篩查將是一個行之有效的臨床方法，但由于其他腫瘤細胞和組織中PCGEM1也呈現高表達狀態。因此，應用PCGEM1對肝癌高危人群進行篩查時，表達升高的篩查對象需進一步進行相關的實驗室檢查(血清甲胎蛋白檢查)和影像學檢查，以明確是否發生肝細胞癌。綜上所述，對于已經確診的肝細胞癌患者，lncRNA PCGEM1表達量越高則腫瘤較大且惡性程度高，提示患者預后可能較差。