血液細胞重編程為神經細胞的研究進展

翁曉濱，王躍嗣

濱州醫學院，山東煙臺264003

神經退行性疾病是由神經元和（或）其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化并出現功能障礙，從而表現出一系列與神經退行相關的臨床癥狀。神經退行性疾病是人口老齡化進程中必然出現的一類疾病，在其疾病過程中所伴隨的病理變化是不可逆的，當前的治療方法仍停留在通過藥物控制其病情進展階段。近年來，細胞替代療法治療神經退行性疾病展現出了巨大潛力。細胞替代療法是指用功能正常的細胞替代體內的病變、損傷細胞，從而實現功能修復的治療方法，其實質是直接將細胞作為藥物，通過細胞移植的方法，用健康細胞替代病變細胞對各種疾病進行治療的方法。隨著體細胞重編程概念引入，細胞替代療法中源頭細胞的選擇不斷豐富。近年來，體細胞重編程為神經細胞用于神經退行性疾病治療受到廣泛關注，而供體細胞的選擇仍然多以成纖維細胞為主，在成纖維細胞獲取過程中必然產生一定程度損傷，對其擴增極易造成后代畸變，并且異體來源的成纖維細胞會引起免疫排斥反應。血液細胞作為臨床診斷中常用的細胞來源，其采樣方便，細胞活力好、創傷小，現已成為重編程的最佳來源細胞。血液細胞最初在神經細胞重編程領域的研究是采用新生兒臍血來源的CD34+細胞［1］。目前，已有多種血液細胞進行神經細胞重編程，如外周血單個核細胞（PBMC）、T 細胞、混合外周血細胞（PBC）等均可誘導為神經細胞。本文結合文獻就血液細胞重編程為神經細胞的研究進展作一綜述。

1 能夠誘導為神經細胞的血液細胞

最初用于誘導神經細胞的血液細胞是新生兒臍血細胞（HUCB），因為HUCB中含有豐富的胎盤樣干細胞和祖細胞，可快速高效地轉化為神經細胞。隨著研究不斷深入，目前已有多種血液細胞可用于誘導神經細胞，如PBMC、T細胞、PBC等。

1.1 PBMC PBMC 是指外周血中具有單個細胞核的細胞，通常采用密度梯度離心法分離。以往供體細胞必須經過擴增傳代來滿足重編程所需要的細胞數量，這會讓細胞具有譜系代數的異質性，而PBMC則避開了這一缺點，一次取材可獲得大量細胞，使PBMC 成為更加優質的候選細胞。近年來，對于PBMC 誘導分化為神經細胞的研究相對較少，轉化效率為0.6%～6%。2016 年，TANG 等［2］從一位33歲健康男性供血者中提取PBMC，利用非整合性附著載體來傳遞重編程基因（OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-Myc、KLF-4、SV40LT）去轉染PBMC，結果發現采用PBMC 誘導的神經干細胞（HiNSC）具有強大的擴增能力，誘導7 周后成功分化為MAP2+神經元，并表達成熟神經元表面標志物NeuN。該研究成果為體細胞重編程為神經細胞擴展了供體細胞來源。YUAN 等［3］采用編碼OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc的非整合仙臺病毒載體轉染PBMC，經過14～35 d誘導，出現了廣泛的HiNSC 克隆；經過10 d 誘導成功定向分化為多巴胺能神經元，分化成熟的多巴胺能神經元不僅表達中腦腹側神經元標志物和核受體相關因子，還具備電生理活性，通過細胞移植治療帕金森病（PD）小鼠能夠明顯改善其臨床癥狀。同樣，ZHENG 等［4］采用編碼OCT3/4、SOX2、KLF4、c-Myc的仙臺病毒載體轉染PBMC，經過2 個誘導階段（約42 d），成功將PBMC 分化為中腦腹側神經元，移植入PD 小鼠后能夠明顯改善其運動功能。這些研究為神經退行性疾病的治療提供了依據。

采用PBMC 作為重編程的供體細胞，能夠避開傳統采用成纖維細胞作為重編程的供體細胞對人體本身的侵入性損害，如采用成纖維細胞需要開放性皮膚活檢，而且在實驗過程中，成纖維細胞需要不斷傳代以獲得足夠數量的實驗細胞，在此過程中會引發基因突變的風險。但在對血液細胞重編程過程中，都使用了c-Myc這一原癌基因。OKITA等［5］研究表明，c-Myc 在血液細胞重編程過程中對誘導細胞衍生后代具有癌變風險。但目前尚無血液細胞所衍生的神經細胞在成瘤性方面的報道。因此，對于PBMC 重編程為神經細胞的風險仍需進一步探索，并且在實驗過程中，重編程和神經元分化過程耗時久、效率低，仍有許多問題亟待解決。

1.2 T細胞 T細胞是一種終末分化的循環淋巴細胞。大多數研究認為，唯一有可能改變譜系特征的是未分化的干細胞和祖細胞，如成纖維細胞，而在終末分化的T 細胞上不會發生改變。TANABE 等［6］從1 名健康成人新鮮血液中分離出T 細胞作為起始細胞，使用游離載體編碼BRN2、ASCL1、MYT1L、NGN2四個轉錄因子后進行重編程，成功誘導分化出成熟的神經元細胞。為了驗證該方法的普遍適用性，他們又采集了35名不同年齡段、不同種族和性別的健康成人血液進行重編程，結果均誘導分化出成熟的神經元細胞。1 mL 外周血細胞在不需要初始擴增的情況下，一步就可以誘導產生5 萬多個神經元細胞，其重編程效率達到6.2%。這些研究表明，細胞轉分化能力并非僅限于未分化的祖細胞，終末分化的體細胞通過重編程亦可分化為譜系親緣關系較遠的體細胞，并能獲得較高的轉化效率［7-8］。T 細胞的重編程轉化效率雖然比同類研究較高，但與成纖維細胞相比，其轉化效率仍然較低。

1.3 PBC PBC 是血液細胞誘導為神經細胞的常規來源細胞，除了正常人的PBC 可作為重編程的候選細胞外，阿爾茨海默病、PD 患者的PBC 亦可定向誘導分化為神經細胞。研究表明，PBC 相較于其他血液細胞，可快速穩定地向神經細胞轉化。2018 年SHENG 等［9］以仙臺病毒作為載體，非整合SOX2、c-Myc 兩個基因，在培養過程中添加小分子GSK3β抑制劑、Hedgehog 活化劑、ALK-5 抑制劑、重組人白血病抑制因子和苯環丙胺，在7 d 內就可將PBC 轉化為HiNSC，轉化效率為0.08%～0.66%，繼續誘導分化6 周后，PBC 來源的HiNSC 分化為成熟的神經元細胞。該研究還發現，直接轉誘導的HiNSC 在很大程度上喪失了其親代PBC 的年齡相關性DNA 甲基化模式，其新生成的HiNSC 更年輕化。有研究認為，多能性因子OCT4 會引起遺傳畸變和染色體不穩定［10］。本研究在未使用OCT4 的情況下，誘導分化形成的HiNSC 具備新生成細胞的譜系特征，在神經退行性疾病治療上更具有臨床價值。

1.4 HUCB HUCB 是新生兒娩出后，殘留在胎盤和臍帶中的血液。臍血來源的細胞是最具年輕化的細胞，免疫原性較弱，是細胞生物治療、組織工程學等潛在的候選細胞。有研究報道，臍血中含有胚胎樣干細胞和祖細胞，能夠在培養過程中迅速高效地增殖，對其定向培養和誘導可分化為神經元細胞、神經膠質細胞［11］。WALCZAK 等［12］成功將臍血來源的細胞定向分化為神經元細胞，并將分化的神經元細胞移植入小鼠紋狀體中，免疫組化顯示移植后臍血來源的神經元細胞能夠在小鼠腦內存活并表達早期神經元標志物。HUCB 因其自身的突出特征，其在神經退行性疾病的生物學治療中顯示出強大的臨床應用前景。

2 血液細胞作為供體細胞誘導為神經細胞的技術困難

現階段，血液細胞向神經細胞轉化的研究相對較少，仍面臨許多亟待解決的技術困難，如轉染多個轉錄因子的異質性、血液細胞重編程效率低等。

2.1 轉染多個轉錄因子的異質性 在重編程過程中，部分供體細胞不能同時轉染到幾個甚至十幾個轉錄因子，這部分供體細胞不能轉變為神經細胞，也不同于供體細胞，即在重編程過程中產生了異質性。目前，多數研究產生的特定神經元類型多為混合型或其他非典型的細胞類型［13］。如在產生特定多巴胺能神經元的研究中，這種異質性使得體外模型建立以及體內追蹤多巴胺能神經元變得困難。有研究試圖將誘導得到的多巴胺能神經元進行純化，培養25 d時純化的Th 陽性細胞僅達到70%［14］。此外，異質性可引起移植后宿主體內腫瘤形成、異動癥等其他未知風險的發生，給患者帶來了潛在的、不可預估的安全風險［15］。現階段針對特定神經細胞的優化方案并不十分完美，均無法回避血液細胞重編程為特定神經細胞時的異質性問題。

2.2 血液細胞重編程效率低 相較于重編程轉化種子細胞的成纖維細胞，血液細胞的誘導分化效率低這一技術難題一直未被突破，這也限制了血液細胞重編程為神經細胞的臨床應用［16］。學者們通過多種方法來提高重編程效率，如有研究發現分化潛能高的造血祖細胞重編程效率高于終末分化的T細胞和B 細胞，表明細胞的分化狀態可能對血液細胞的重編程效率有一定影響［17-18］。細胞的表觀遺傳學不管是在干細胞還是在體細胞均普遍存在，表觀遺傳因子的靶點是某一功能的一群基因，而不是某一個基因，實現靶向性必須依賴其他因子的共同作用。有研究報道，轉錄因子的基因沉默能夠抑制某些表觀遺傳學作用［19］。因此，對這些機制進行干擾有可能會提高血液細胞的重編程效率。

3 轉錄因子在血液細胞重編程為神經細胞過程中的作用

3.1 SOX2 在血液細胞重編程為神經細胞中的作用 SOX2 基因定位于人染色體3q26.3-27，其編碼的SOX2 蛋 白由317 個氨基酸組成［20］。AVILION等［21］研究發現，SOX2 蛋白能夠在神經外胚層的HiNSC 中特異性表達，對維持胚胎干細胞的自我更新和干性具有關鍵的調節作用。ELLIS 等［22］通過綠色熒光蛋白標記SOX2 構建轉基因小鼠模型，證實SOX2不僅表達于胚胎神經祖細胞，還可表達于成體中樞神經系統的增殖細胞以及一些神經組織，如側腦室下區、海馬齒狀回的顆粒下層等。因此，在血液細胞重編程為神經細胞過程中，研究者們常常加入SOX2以加速重編程進程。

3.2 OCT4 在血液細胞重編程為神經細胞中的作用 OCT4 屬于POU 轉錄因子家族成員之一，能夠激活或抑制多種靶基因表達，是維持胚胎干細胞多能性的關鍵基因［23］。最新的研究發現，OCT4 與SOX2 特異性結合可加速血液細胞重編程進程［24］。因此，OCT4在血液細胞重編程為神經細胞中的作用逐漸受到重視。

3.3 ASCL1 在血液細胞重編程為神經細胞中的作用 ASCL1是堿性螺旋—環—螺旋轉錄因子家族的重要成員，能夠促進高分化潛能細胞向神經元細胞分化［25］，在周圍神經系統和中樞神經系統的發育過程中不可或缺。研究表明，ASCL1 對中樞神經系統中特定神經細胞的增殖具有調節作用，能夠決定特定神經細胞中哪些DNA 序列被開啟或關閉，從而決定這些細胞的形成和功能。

4 血液細胞重編程為神經細胞的臨床應用前景

神經系統是人體內起主導作用的功能調節系統。神經系統發生病變后，病變的神經細胞不能進行有效地再生與修復，故神經系統疾病的致死率和致殘率一直高居榜首。隨著人口老齡化程度加深，神經退行性疾病在老年人群中的患病率明顯上升，但當前的醫療手段仍停留在控制疾病進展階段。因此，替換或修復損傷和缺失的神經細胞成為學者們著力攻克的難題。利用干細胞重編程分化為神經細胞已成為治療神經退行性疾病的研究熱點。學者們通過構建神經系統疾病動物模型，在體外通過相關手段將不同來源細胞重編程為特定的神經細胞，再移植入體內，從而治療神經系統疾病。血液細胞作為臨床診斷中常用的細胞來源，其采樣方便，細胞活力好、創傷小，現已成為重編程的最佳來源細胞，在神經退行性疾病的治療中具有更廣闊的臨床應用前景。

綜上所述，血液細胞重編程為神經細胞將為神經退行性疾病的治療提供了一條新的途徑，相較于其他來源類型的細胞，血液細胞采樣方便，細胞活力好、創傷小，是細胞重編程的最佳來源細胞。但血液細胞重編程過程中也存在一系列技術難題，如轉染多個轉錄因子的異質性、血液細胞重編程效率低等。如能解決這些技術難題，血液細胞重編程為神經細胞在神經退行性疾病治療中的應用前景將更加廣闊。