竹蓀廢棄物的多糖活性研究及其單糖組成毛細管電泳測定分析

白新偉

（六盤水師范學院化學與化學工程系，貴州 六盤水 553004）

竹蓀［1］又稱竹參，擔子菌綱，是含有豐富的維生素［2］、氨基酸［3］、多糖［4］的名貴食用菌。竹蓀可食用部分只包含菌裙和菌柄，菌托和菌蓋因口感較差而采收過程中被丟棄，

而竹蓀食用部分菌體只占質量的三分之一，即每生產1000g的鮮商品竹蓀，相應廢棄2000g菌蓋、菌托。據此估算，僅貴州省織金縣［5］每年勢必有400余噸的竹蓀副產物因為技術水平與產品轉化率低被視為廢棄物處理，造成巨大的資源浪費。

多糖是是由糖苷鍵結合的糖鏈，至少要超過10個的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合，具有較強的抗氧化活性和抑菌性。岳誠［6］研究表明，三七多糖還原／抗氧化能力和清除DPPH自由基能力都比茶多酚強；吳雙雙［7］研究的紫薯粗多糖的抗氧化試驗結果顯示，其對·OH和DPPH·均表現出良好的清除效果。王世佳［8］在對桔梗多糖的研究中發現，桔梗多糖脫蛋白后對根霉、曲霉、黃曲霉均有較好抑制作用，且隨多糖濃度增加抑制作用增加。而對竹蓀多糖抗氧化、抑菌性能力的研究較少，尤其是未見對竹蓀加工廢棄物菌托、菌蓋多糖的研究。因而本研究對竹蓀廢棄物進行多糖的分離、對各組分抗氧化活性、抑菌性進行比較，并對多糖水解液的單糖進行毛細管電泳分離分析，旨在為竹蓀廢棄物的開發及生物活性研究提供理論依據，為竹蓀加工企業產品類型由竹蓀飲料等傳統產業，不斷向竹蓀竹蓀多糖化妝品、天然食品防腐劑等深加工、精加工產品轉型奠定理論基礎，以期為提升竹蓀菌附加值、拓展竹蓀產業鏈服務。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

K1050毛細管電泳儀、（ZKGL-6020D型真空干燥箱、HH-2電熱恒溫水浴鍋、721／722分光光度計、 無水乙醇、氯仿、正丁醇、ABTS、考馬斯亮藍。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖提取

竹蓀菌托、菌蓋多糖的提取參照文獻 ［9］。粗多糖以NaCl溶液進行洗脫進一步得到3個洗脫峰，組分為POP-a，POP-b，POP-c。

1.2.2 多糖水解液的衍生

取上述竹蓀多糖5 mg，加入2 mol／L的三氟乙酸1 mL，封口后于100℃下水解9 h。依次向安培瓶中加入100μL 5.0×10-2mol／L 1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮、10μL竹蓀多糖水解液、10μL氨水溶液，將其密封，在80℃水浴加熱，待其反應10 min后，取出用N2吹干，加1mL乙腈溶解備用。

1.2.3 抗氧化活性測定

1）對 DPPH·［10］的清除能力。配制1～7mg／mL的多糖水溶液、0.125 mmol／L DPPH甲醇溶液，517 nm處測定吸光值。清除率＝ ＼［1-（Ac-Ab）／Aa＼］ ×100%。式中：Aa為 DPPH、甲醇混合液的吸光度，Ab為多糖、甲醇混合液的吸光度，Ac為多糖、DPPH混合液的吸光度。

2） -OH［11-12］的清除能力。取樣品溶液1 mL，依次加入FeSO4和H2O2、水楊酸溶液1 mL，在510 nm波長處測其吸光度值。清除率＝＼［1-（Ab-Ac）／Aa）］ ×10‰式中：0A0為水楊酸溶液、空白溶劑混合液的吸光度，Ab為樣品、水楊酸混合溶液的吸光度度；Ac為多糖溶液、空白溶劑混合后的吸光度。

3）對 ABTS+［13，14］的清除能力，配制 7 mmol／L ABTS溶液，取0.2 mL多糖溶液，再加入1 mL稀釋后的ABTS溶液，736 nm處測定各樣品的吸光度值。清除率＝（1-Ab／Aa） ׉式中：Aa為蒸餾水測定值，Ab為樣品溶液的測定值。

4）對超氧陰離子［15，16］清除能力，取不同濃度的多糖溶液0.1 mL，分別加入0.1 mol／L硼砂緩沖溶液2 mL，鄰苯三酚溶液0.1 mL，325 nm處測吸光度。清除率 ＝（Va-Vb／Va） ×100式中：Va為空白管的自氧化速率 （ΔA／min）；Vb為加入樣品的自氧化速率 （ΔA／min）。

1.2.4 抑菌性測定

將干燥的藥敏紙片置不同濃度的竹蓀多糖液組分中，分別將培養的菌株，涂抹在不同細菌、真菌菌種的瓊脂培養基上，置30℃恒溫培養24 h，觀察抑菌圈。實驗的每組分多糖設置了5個多糖的濃度梯度，即 10，20，40，80，160mg／mL，由抑菌圈的大小分析各多糖組分的抑菌效果。

1.2.5 單糖衍生物、竹蓀廢棄物多糖水解液毛細管電泳分析

在緩沖溶液硼酸鹽的濃度為15 mmol／L（pH＝9.3），表面活性劑十二烷基硫酸鈉為25 mmol／L，分離電壓為12 kV，溫度為25℃的最佳分離效果的條件下進行分離分析。

2 結果與討論

2.1 抗氧化活性

從圖1可知，在相同濃度下清除率大小順序為POP＞POP-a＞POP-b＞POP-c，竹蓀廢棄物多糖組分對DPPH自由基的清除率隨濃度減小而減小，粗多糖及3種分離組分清除率從1 mg／mL時的60%、38% 、35% 、30%增加到7 mg／mL濃度時的80%、70%、62%、60%但都低于同濃度下VC的清除率96%。

圖1 不同濃度多糖組分對DPPH自由基清除率

不同濃度的竹蓀廢棄物多糖組分對羥自由基的清除率都隨著濃度的增加而增加 （圖2），在相同濃度下清除率大小順序為 VC＞POP＞POP-a＞POP-b＞POP-c，粗多糖及3種分離組分清除率在7 mg／mL時分別達到75%、60%、53% 、46%低于Vc對羥基自由基的92%。

圖2 不同濃度多糖組分對羥自由基清除率

不同濃度的竹蓀廢棄物多糖組分對ABTS+自由基的清除率都隨著濃度的增加而增加，在相同濃度下粗多糖清除率高于其他分離成分，在質量濃度為7 mg／mL時清除率都達到最大值。見圖3。

圖3 不同濃度竹蓀廢棄物多糖組分對ABTS+自由基清除率

從圖4可知，竹蓀廢棄物多糖組分對超陰離子的清除率都隨著濃度的增加而呈上升的趨勢，質量濃度低于3mg／mL時幾種多糖組分對超陰離子的清除率基本相近，當濃度大于3mg／mL時粗多糖的清除率顯著高于其它幾種組分，同濃度下VC的清除率仍然最高。

圖4 不同濃度竹蓀廢棄物多糖組分對超氧陰離子自由基清除率

2.2 抑菌活性

竹蓀多糖中粗多糖POP對細菌的抑菌效果略低于苯甲酸但高于POP-a、POP-b、POP-c三種組分；粗多糖及3種組分對乳酸菌的抑制作用顯著強于對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、根瘤菌的抑制作用，對五種細菌的抑菌圈大小見表1。

表1 多糖各組分對細菌抑制作用

抑制真菌活性：多糖濃度為 160mg／mL時，POP、POP-a、POP-b、POP-c對三種真菌的抑制作用見表2。竹蓀多糖中粗多糖POP對三種真菌的抑菌效果略低于苯甲酸但明顯高于POP-a、POP-b、POP-c三種組分；POP-a、POP-b、POP-c組分對三種真菌的抑制效果無明顯差異。

表2 多糖各組分真菌抑制作用

2.3 糖類的分離

2.3.1 標準品的分離

在緩沖溶液硼酸鹽的濃度為15 mmol／L，表面活性劑十二烷基硫酸鈉為25 mmol／L，分離電壓為12 kV，溫度為25℃的最佳分離效果的條件下對標準混合液進行分離分析，分離分析結果見圖5（A），竹蓀多糖水解液進行分離分析，分離分析結果見圖5（B）。

圖5 標準品 （A）、竹蓀 （B）電泳譜圖

2.3.2 樣品的分離測定

在上述最優條件下對竹蓀多糖樣品進行分離分析。竹蓀多糖樣品由 Gal、Man、Glc三種單糖組成，其質量分數分別為0.71、0.38、0.68!mol／g，Ara、Fuc兩種單糖均未檢測到。線性方程、線性范圍及檢測限相關數據見表3。

表3 單糖的線性方程、相關系數、線性范圍及檢出限

在最優化條件下，各單糖峰面積相對標準偏差均小于2.6%，遷移時間相對標準偏差均小于1.8%，表明方法具有較好的重現；各單糖回收率在94.3%～103.4%，顯示該方法具有較好的準確性。

3 結論

從竹蓀廢棄物提取的多糖，經分離純化后得到3個組分POP-a、POP-b、POP-c，不同的多糖組分對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率都隨著稀釋倍數增加而減小，且都低于同濃度下VC的清除率，粗多糖的清除率高于各分離組分，3種分離組分對自由基清除率的大小順序為：POP-a＞POP-b＞POP-c，這與3種組分的分子量大小、單糖組成及糖鏈的結構不同有關。竹蓀多糖中粗多糖POP對細菌和真菌的抑菌效果略低于苯甲酸但高于POP-a、POP-b、POP-c三種組分對竹蓀廢棄物進行多糖提取、分離，并對各組分不同濃度下的抗氧化活性、抑菌性進行了比較，膠束毛細管電泳法對糖的分離分析，具有線性范圍寬、重現性好、快速高效等特點，可用作竹蓀中單糖組成測定的常規方法，據此為竹蓀廢棄物的開發及生物活性研究提供理論依據，為竹蓀加工企業產品類型由竹蓀飲料等傳統產業，不斷向竹蓀竹蓀多糖化妝品、天然食品防腐劑等深加工、精加工產品轉型奠定理論基礎，以期為提升竹蓀菌附加值、拓展竹蓀產業鏈服務。