TLR4/MyD88/NF-κB在克羅恩病結腸組織的表達及臨床意義

朱瑞齊 莊培麗 周璐 王丹丹 馮百歲

[關鍵詞] 克羅恩病;TLR4;MyD88;NF-κB

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）29-0017-04

Expression and clinical significance of TLR4/MyD88/NF-κB in the colonic tissues of patients with Crohn′s disease

ZHU Ruiqi? ?ZHUANG Peili? ?ZHOU Lu? ?WANG Dandan? ?FENG Baisui

Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou? ?450003， China

[Abstract] Objective To explore the expressions of toll-like receptor 4 （TLR4）， myeloid differentiation factor 88 （MyD88） and nuclear factor kappa B （NF-κB） in the colonic tissues of patients with Crohn′s disease （CD） by immunohistochemistry， and to analyze whether there are differences between groups and whether there is any correlation between them and disease activity. Methods A total of 17 colonic tissue specimens from CD patients hospitalized in The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University and 5 colonic tissue specimens from the control group were collected. The expressions of TLR4， MyD88 and NF-κB were compared between the two groups，and their expressions in the groups with different severity of CD were also compared to see if there was any difference. Results The expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κB in colonic tissues were higher in the CD group than those in the normal control group. The expression levels of TLR4 and MyD88 were significantly moderately correlated with erythrocyte sedimentation rate （ESR）， and the expression level of NF-κB was significantly moderately correlated with C-reactive protein （CRP） and albumin levels. Conclusion The expressions of TLR4， MyD88， and NF-κB in colonic tissues of CD patients are higher than those in normal colonic tissues， and the TLR4/MyD88/NF-κB pathway plays an important role in the pathogenesis of CD. The expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κB are significantly correlated with various inflammatory indicators.

[Key words] Crohn′s disease; Toll-like receptor 4; Myeloid differentiation factor 88; Nuclear factor kappa B

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種與人體免疫密切相關的慢性腸道疾病，包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD），典型臨床表現為持續或反復發作的腹痛、黏液膿血便和體重減輕等，可伴有皮膚、眼部、肝膽等腸外表現[1]。近20余年來，我國IBD患者就診人數呈快速上升趨勢[2]。IBD的病因及發病機制尚不明確，遺傳、環境、免疫失調等多種因素均參與其發病[3]。越來越多的研究證實，炎癥反應相關通路在CD發病中尤為重要。

有研究發現，在葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）誘導的小鼠結腸炎模型中發現小鼠結腸組織炎癥部位TLR4、MyD88、NF-κB高表達，并且通過一種新型可溶性蛋白HM0539證明該物質可通過減少TLR4的激活并抑制MyD88的轉導來調節下游NF-κB的激活對小鼠結腸炎顯示出顯著的保護作用[4-5]。TLR是先天性免疫識別受體的重要部分，在對病原微生物的識別中發揮著重要作用，TLR4通過非特異性地和病原相關分子結合啟動信號轉導，引發腸道炎癥介質的釋放，參與UC的發病[6]。MyD88是含有TLR結構域的接頭蛋白，它作為TLR信號通路中的下游信號因子在TLR信號通路中起著關鍵作用[7]。TLR4可通過MyD88途徑進行信號通路的轉導。NF-κB是一種高度保守的轉錄因子，廣泛存在于各種組織，在免疫和炎癥反應中有著重要地位，NF-κB是多種信號轉導途徑的匯聚點，在腫瘤及炎癥反應相關基因的表達中起著至關重要的作用[8-9]。越來越多的研究證實，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在UC的發病中有重要作用[10]。但該通路在CD發病中作用有待進一步研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年12月至2020年12月鄭州大學第二附屬醫院消化內科入院治療的CD患者內鏡活檢標本或手術切除的結腸組織標本共17例，其中男12例，女5例。CD的診斷及評估標準均嚴格按照2018年炎癥性腸病學組制定的共識執行。所選患者排除其他自身免疫性疾病、嚴重營養不良及急性感染性疾病。收集5例同時期住院行結直腸癌手術的患者切緣陰性的組織標本作為對照組，并由專業的病理醫生確認。上述實驗方案均經鄭州大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準同意后實施，所選患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

通過免疫組織化學法檢測結腸組織TLR4、MyD88、NF-κB的表達情況，所用主要試劑為北京Bioss公司生產的兔源Toll樣受體4抗體和兔源MyD88抗體及Affinit公司生產的兔源NF-κB p65抗體;通過入院病歷收集患者的性別、年齡、病程等資料，記錄患者入院時的癥狀（腹痛、大便次數等）、體征、既往史等，收集入院后首次血常規、肝功、ESR、CRP、腸鏡報告等。采用Best CDAI評分對CD患者的病情評估并分組，共包含稀便次數、腹痛程度、一般情況、腸外表現與并發癥、阿片類止瀉藥、腹部包塊、血細胞比容降低值、100×（1-體重/標準體重）共8項指標，計算各指標得分后乘以相關權重得出總分，<150分為緩解期，≥150分為活動期，其中150～220分為輕度，221～450分為中度，>450分為重度。

1.3 免疫組織化學染色結果分析

免疫組化的結果在400倍高倍鏡下觀察，隨機選取3個不同視野計算均值。①計數標準：陽性細胞百分比：0～5%計0分;6%～25%計1分;26%～50%計2分;51%～75%計3分;>75%計4分。②染色強度：無著色為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;黃褐色為3分;然后計算上述兩項得分的乘積，所得值即為陽性等級評分：0分計為陰性，1～4分計為弱陽性，5～8分計為陽性，9～12分則計為強陽性，染色結果由2位病理科醫生在雙盲情況下觀察所得。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件分析并處理數據，計量資料采用（x±s）表示，計數資料采用χ2檢驗，各組數據經方差齊性或正態檢驗后，兩組或多組比較采用單因素方差分析的S-N-K多重比較或秩和檢驗，相關性分析采用Spearman相關性分析，檢驗標準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

收集17例CD患者結腸組織標本，根據Best CDAI評分對患者的病情程度進行評估，其中緩解期6例，輕度6例，中重度5例，同時收集5例結直腸癌手術患者的切緣組織的病理蠟塊;組間性別和年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 免疫組化法檢測CD患者結腸組織TLR4、MyD88和NF-κB的表達

2.2.1 TLR4? 為廣泛表達的受體，在多種炎性細胞及結腸組織的黏膜上皮細胞等均可表達，對照組和CD組相比陽性細胞占比更少且染色程度更輕，CD組間均可見大量呈淡黃色或棕黃色的陽性區域?；颊呓Y腸組織TLR4表達的陽性等級評分平均水平，中重度CD組為（6.80±1.98）分、輕度CD組（6.50±2.03）分、緩解期CD組為（4.83±1.05）分，較對照組的（2.33±0.47）分表達水平均升高，差異均有統計學意義;CD組組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1、封三圖1。

2.2.2 MyD88? 定位于細胞質，表達情況如下，對照組和緩解期CD組與活動期CD組相比陽性細胞占比更少且染色程度更輕，活動期CD組可見中等至大量呈淡黃色或棕黃色的區域。結腸組織MyD88表達的陽性等級評分的平均水平如下，中重度CD組為（5.80±0.56）分、輕度CD組為（6.00±1.25）分，較緩解期CD組（2.94±1.53）分和對照組（1.13±0.41）分表達升高，差異均有統計學意義，輕度CD組和中重度組間相比以及緩解期組和對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、封三圖2。

2.2.3 NF-κB? 為廣泛表達的受體，是諸多信號通路核心樞紐之一，靜息狀態下多存在于細胞漿，活化后則存在于細胞核。其表達情況，CD各組和對照組相比陽性細胞占比更多且染色程度更重，CD組間均可見大量呈棕黃色或者黃褐色陽性區域。患者結腸組織NF-κB表達的陽性等級評分平均水平，中重度CD組為（7.93±1.17）分、輕度CD組為（6.83±2.19）分、緩解期CD組為（5.17±1.24）分，較對照組的（2.93±0.60）分水平高，差異有統計學意義（P<0.05）;緩解期組相比輕度CD組，差異無統計學意義（P>0.05）;相比中重度組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2、封三圖3。

2.3 TLR4、MyD88和NF-κB的表達與各臨床指標及彼此之間的相關性分析

相關性分析結果顯示，NF-κB與CRP間存在顯著的中等強度正相關，與白蛋白存在顯著的中等強度負相關，與其余指標無明顯相關;TLR4和MyD88與ESR間存在顯著的中等強度正相關，與其余指標無明顯相關，即TLR4、MyD88、NF-κB與炎癥指標關系密切。TLR4、MyD88和NF-κB在CD組表達升高且彼此間存在不同程度的正相關，TLR4和MyD88間存在顯著強相關，MyD88與NF-κB間存在顯著強相關，可以推測上述指標與CD發病及疾病活動關系密切。見表3。

3 討論

IBD 是一組病因不明、發病機制不清的腸道慢性炎癥性疾病，包括 UC和CD兩種類型。CD病變可累及整個消化道，主要癥狀為腹痛和腹瀉，可伴體重減輕、發熱、疲勞、貧血等全身表現，可并發瘺管、腹腔膿腫、腸腔狹窄、腸梗阻和肛周膿腫等并發癥，嚴重影響患者的生活質量[2]。近年來我國IBD發病及就診人數不斷上升，給社會及患者家庭帶來巨大的負擔[11]。隨著越來越多的生物制劑不斷問世及投入使用，很大程度地改善患者的生活質量，但不是所有患者均對生物制劑應答良好，且目前仍缺乏能根治或長期有效維持緩解的手段，現有研究表明免疫功能紊亂在IBD發病中占重要地位，所以對于IBD發病機制的研究非常重要。

本研究中，通過免疫組化的方法檢測CD結腸組織中TLR4、MyD88和NF-κB的表達發現TLR4、MyD88和NF-κB在CD患者的結腸黏膜中表達均高于對照組，活動期的CD結腸組織中MyD88的表達高于緩解期，下游分子NF-κB在中重度患者的表達也高于緩解期的患者。同時，相關性分析結果顯示，NF-κB與CRP間存在顯著的中等強度正相關，與白蛋白存在顯著的中等強度負相關。TLR4和MyD88與ESR間存在顯著的中等強度正相關，上述結果提示TLR4、MyD88、NF-κB與CD的發病關系密切且與疾病活動度相關。相關分析還顯示，TLR4和MyD88間存在顯著強相關，而MyD88與NF-κB也存在顯著強相關，所以本研究推測該通路聯系緊密，彼此間以正向調節的形式參與CD發病，且信號間的傳遞受其他因素干擾較小。

有研究證實，通過應用NF-κB抑制劑PDTC等證明通過抑制NF-κB信號轉導，可以減輕腸道的炎癥反應[12]。不僅如此，益生菌、短鏈脂肪酸、寡糖等有利于減輕腸道炎癥反應的物質均有抑制NF-κB表達的作用[13-15]。但NF-κB作為多條信號通路的共同下游信號因子，除本文中提到的TLR4/MyD88/NF-κB通路外，MLCK/NF-κB[16]和TLR4/MAPK/NF-κB[13]等信號通路也參與了IBD的發病，具體哪條通路更重要，其機制復雜仍需進一步研究。不僅如此，通過CD147刺激腸上皮細胞中NF-κB的磷酸化，會加重腸道炎癥反應[17]。種種跡象均表明NF-κB在IBD的發病中非常重要。此外，TLR4非特異性地和病原相關分子結合啟動信號轉導，通過抑制其表達也可以發揮減輕腸道炎癥反應的作用[18]。但作為上游信號因子，TLR4不僅可通過經典的MyD88誘導NF-κB的表達增加，還可以通過非經典的MyD88途徑及MAPK等途徑來誘導NF-κB的表達增加[19]。所以，本研究可通過TNBS誘導的小鼠結腸炎模型驗證上述結果，同時通過特異性的抑制MyD88的表達來觀察NF-κB的表達情況及對腸道炎癥反應的抑制作用。

綜上所述，CD結腸組織中TLR4、MyD88和NF-κB的表達在本實驗中相比于對照組表達增加，且TLR4、MyD88和NF-κB與疾病活動度相關的臨床炎癥指標間存在相關性。但本研究為單中心小樣本研究，免疫組化的結果也存在一定的主觀差異，所以仍需更多的實驗驗證上述結果，需要相關的動物或細胞實驗驗證上述通路的具體機制。

[參考文獻]

[1] Kaser A，Zeissig S，Blumbegr RS. Inflammatory bowel disease[J]. Annu Rev Immunol，2010，28：573-621.

[2] 吳開春，梁潔，冉志華，等.炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年·北京）[J]. 中國實用內科雜志，2018，38（9）：796-813.

[3] Kobayashi T，Siegmund B，Le Berre C，et al. Ulcerative colitis[J]. Nat Rev Dis Primers，2020，6（1）：74.

[4] Chen YY，Li RY，Shi MJ，et al. Demethyleneberberine alleviates inflammatory bowel disease in mice through regulating NF-kappaB signaling and T-helper cell homeostasis[J]. Inflamm Res，2017，66（2）：187-196.

[5] Li Y，Yang S，Lun J，et al.Inhibitory effects of the lactobacillus rhamnosus GG effector protein HM0539 on inflammatory response through the TLR4/MyD88/NF-small ka，cyrillicB axis[J]. Front Immunol，2020，11：551 449.

[6] Shi YJ，Gong HF，Zhao QQ，et al. Critical role of toll-like receptor 4 （TLR4） in dextran sulfate sodium （DSS）-induced intestinal injury and repair[J]. Toxicol Lett，2019， 315：23-30.

[7] Nagpal K，Plantinga TS，Wong J，et al. A TIR domain variant of MyD88 adapter-like（Mal）/TIRAP results in loss of MyD88 binding and reduced TLR2/TLR4 signaling[J]. J Biol Chem，2009，284（38）：25 742-25 748.

[8] Huang YF，Li QP，Dou YX，et al. Therapeutic effect of brucea javanica oil emulsion on experimental Crohn′s disease in rats：Involvement of TLR4/ NF-kappaB signaling pathway[J]. Biomed Pharmacother，2019，114：108 766.

[9] Gambhir S，Vyas D，Hollis M，et al. Nuclear factor kappa B role in inflammation associated gastrointestinal malignancies[J].World J Gastroenterol，2015，21（11）：3174-3183.

[10] Brenna O，Furnes MW，Drozdov I，et al. Relevance of TNBS-colitis in rats：A methodological study with endoscopic，histologic and transcriptomic[corrected] characterization and correlation to IBD[J]. PLoS One，2013，8（1）： e54 543.

[11] Park J，Cheon JH. Incidence and prevalence of inflammatory bowel disease across asia[J].Yonsei Med J，2021， 62（2）： 99-108.

[12] Jia Q，Zhang H，Su Y，et al. Strictosamide alleviates the inflammation in an acute ulcerative colitis （UC） model[J]. J Physiol Biochem，2021，77（2）：283-294.

[13] Lu K，Zhou J，Deng J，et al.Periplaneta americana oligosaccharides exert anti-inflammatory activity through immunoregulation and modulation of gut microbiota in acute colitis mice model[J]. Molecules，2021，26（3）：1718.

[14] Kikut J，Konecka N，Zietek M，et al. Diet supporting therapy for inflammatory bowel diseases[J]. Eur J Nutr，2021， 148（6）：1087-1096.

[15] Guo C，Wang Y，Zhang S，et al. Crataegus pinnatifida polysaccharide alleviates colitis via modulation of gut microbiota and SCFAs metabolism[J]. Int J Biol Macromol，2021，181：357-368.

[16] Al-Sadi R，Engers J，Haque M，et al. Matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） induced disruption of intestinal epithelial tight junction barrier is mediated by NF-kappaB activation[J].PLoS One，2021，16（4）：e249 544.

[17] Xu Z，Liu R，Huang L，et al. CD147 Aggravated Inflammatory Bowel Disease by Triggering NF-kappaB-Mediated Pyroptosis[J]. Biomed Res Int，2020，2020：5 341 247.

[18] Dejban P，Nikravangolsefid N，Chamanara M，et al. The role of medicinal products in the treatment of inflammatory bowel diseases （IBD） through inhibition of TLR4/NF-kappaB pathway[J]. Phytother Res，2021，35（2）：835-845.

[19] Su Q，Li L，Sun Y，et al. Effects of the TLR4/Myd88/NF-kappaB signaling pathway on NLRP3 inflammasome in coronary microembolization-induced myocardial injury[J]. Cell Physiol Biochem，2018，47（4）：1497-1508.

（收稿日期：2021-05-08）