稀少精子凍融后行卵胞漿內單精子注射對受精結局的影響

馬文葉 程方 劉芳 康卉嫻 唐大偉 白剛 任萌萌 金銳

[關鍵詞] 稀少精子;卵胞漿內單精子注射（ICSI）;睪丸精子抽吸術（TESA）;冷凍復蘇

[中圖分類號] R711.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）29-0032-04

The effect of intracytoplasmic sperm injection after freezing and thawing of rare sperm on the outcome of fertilization

MA Wenye? ?CHENG Fang? ?LIU Fang? ?KANG Huixian? ?TANG Dawei? ?BAI Gang? ?REN Mengmeng? ?JIN Rui

Reproductive Center， Yinchuan Maternity and Child Health Care Hospital， Yinchuan? ?750001， China

[Abstract] Objective To investigate the fertilization outcome of intracytoplasmic sperm injection（ICSI） after freezing and thawing of rare sperm obtained by testicular puncture （TESA） in patients with non-obstructive azoospermia. Methods A total of 200 patients， including the patients with severe oligozoospermia， asthenozoospermia， and teratozoospermia who underwent conventional ICSI on ejaculated sperm and the patients with non-obstructive azoospermia ICSI who underwent ICSI on a small amount of fresh or frozen-thawed sperm obtained by TESA from January 2014 to April 2021 in our center were retrospectively analyzed. They were divided into group A （conventional ICSI sperm group， 107 cases）， group B （frozen TESA sperm group， 35 cases）， group C （fresh TESA sperm group， 58 cases） according to different sperm sources. Through case-control studies， the general clinical data and laboratory data of each group were analyzed and compared. The embryo quality was evaluated. Results There was no significant difference in the number of egg retrieved and egg maturation rate between group B [（11.63±2.87）， 82.31%] and group A （10.81±3.21， 82.63%） and group C （11.46±3.16， 82.41%）（P>0.05）. The normal fertilization rate， normal cleavage rate and high-quality embryo rate of group B （62.99%， 84.83%， 34.64%） were significantly different from those of group A （82.11%， 97.07%， 48.29%） and group C （73.18%， 91.02%， 42.47%） （P<0.05）. Conclusion Intracytoplasmic sperm injection after cryopreservation of rare sperm obtained by testicular sperm aspiration can solve the infertility problem in patients with non-obstructive azoospermia.

[Key words] Rare sperm; Intracytoplasmic sperm injection （ICSI）; Testicular sperm aspiration （TESA）; Cryopreservation

近來，男性精子的數量和質量持續下降，成為造成男性不育的主要因素。有研究顯示，男性不育癥發病率中精子異常占10%左右[1-2]，其中60%～75%的男性不育患者表現為少精、弱精、無精或精子畸形等[3-4]。目前治療嚴重男性不育癥最有效的方法首選卵胞漿內單精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）[5]。另外，少弱精子癥患者通過射精能得到少量精子，睪丸穿刺術（Testicular Sperm Aspiration，TESA）也可以幫助無精子癥患者獲得少許睪丸精子[6]，若將這些精子行ICSI或取卵當日冷凍復蘇后行ICSI，對減少患者反復睪丸穿刺帶來的痛苦及確保取卵當日有足夠的睪丸精子授精等有重要意義，或許能夠解決精液異常患者的不育難題。據《中國不孕不育現狀調研報告》統計，中國現階段育齡人群中不孕不育人數已超過6000萬，從20年前的2.5%～3%上升到現在的15%～20%。其中男方因素約占30%，雙方因素約占20%。且每年有40萬的取卵周期，8萬個ICSI周期;1萬左右精子冷凍周期，需求量在逐年上升[7]。因此，男性生殖健康成為近年來新的研究熱點，且不孕不育已成為繼腫瘤和心腦血管疾病之后的第三大世界醫療難題。

目前由于經過TESA得到的精子數量較少，而且臨床上也未能找到合適的稀少精子冷凍方法，所以對于TESA精子的冷凍效果仍有爭議[8];TESA精子凍融后行ICSI的受精率等實驗室指標及臨床妊娠率等，國內外研究報道不一。所以該如何改善稀少精子凍融后行ICSI的受精率和妊娠率是今后研究的主要內容，同時也為稀少精子冷凍技術的發展提供更有利的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析本中心2014年1月至2021年4月對因嚴重少、弱、畸形精子癥患者射出的精子行常規ICSI及對非梗阻性無精子患者經過TESA得到的少量新鮮或凍融后的精子行ICSI的患者共200例。按精子來源不同分為A：常規ICSI精子組（n=107）;B：冷凍TESA精子組（n=35）;C：新鮮TESA精子組（n=58）。納入標準：①因男方因素導致的不孕;②女方月經周期規律（28～32 d）且年齡≤35歲;③夫婦雙方染色體檢查結果正常;④常規臨床促排卵（COH）。排除標準：①因子宮畸形或子宮內膜異位癥等因素導致不孕;②因輸卵管因素導致不孕;③因卵巢功能障礙導致不孕（獲卵數≤3枚）。

1.2 促排卵方案

均采用高孕激素狀態下促排卵方案或卵泡期長方案，當目標卵泡有2個≥20 mm時，且≥16 mm 占≥14 mm的卵泡數目比>60%時，注射人絨毛膜促性腺激素hCG 5000～10 000后36～38 h，用取卵針在超聲下獲取卵子。

1.3 精子收集

A組：男方禁欲3～5 d后，取卵當日早晨自行取精，精液用常規實驗室方法處理后行ICSI。

B組和C組：①男方在取卵日之前或取卵當天早晨，將經睪丸穿刺手術抽取到的睪丸組織放入裝有培養液的培養皿中;②撕碎取出的睪丸組織;③在倒置顯微鏡下觀察，將含有精子的培養液300 G離心20 min后棄去上清，將沉淀彈松后緩慢加入0.2～0.3 mL受精液;④室溫靜止孵育一段時間后行新鮮TESA精子ICSI，或將TESA獲得的稀少精子凍融后行ICSI。

1.4 精子的冷凍與解凍

精子冷凍：將等量的精子冷凍保護劑與TESA精子培養液充分混勻，用巴斯特吸管吸到提前標記好的冷凍麥管內靜置3～5 min，液氮熏蒸24 h后投入液氮罐中冷凍保存。

精子解凍：取卵當日解凍精子，從液氮罐中取出精子冷凍麥管，室溫放置8～10 min后，放入37 ℃培養箱中，溶解后用洗精液洗滌1次，離心去上清，加入受精液重懸沉淀，孵育一段時間后行ICSI。

1.5 胚胎評分

受精后18～20 h觀察胞漿中是否出現正常受精的兩原核（2PN）;受精后43～45 h、67～69 h觀察胚胎生長情況，對胚胎進行評分。優質胚胎標準：D1為2PN，D2為4細胞，D3為7/8細胞，卵裂球大小均一，細胞碎片≤10%。

1.6 統計學方法

應用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以（x±s）表示，滿足方差齊性時采用獨立樣本t檢驗，不滿足方差齊性時采用Mann-Whitney檢驗;計數資料以率[n（%）]表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組臨床一般資料比較

三組患者的年齡、不孕年限、激素水平、用藥總量和天數等相比，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 三組行ICSI后實驗室指標比較

B組獲卵數、卵子成熟率[（11.63±2.87）枚，82.31%]與A組[（10.81±3.21）枚，82.63%]和C組[（11.46±3.16）枚，82.41%]相比，差異無統計學意義（P>0.05）;B組的正常受精率、正常卵裂率、優質胚胎率（62.99%、84.83%、34.64%）與A組（82.11%、97.07%、48.29%）和C組（73.18%、91.02%、42.47%）相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

隨著現代社會的快速發展，空氣污染及空氣顆粒物、電磁輻射、生活節奏加快、經濟壓力增加、遺傳因素以及不良的個人生活習慣等導致男性的生精細胞嚴重損害、不育和不良妊娠結局增多[9]。上海計劃生育研究所家庭計劃指導與服務中心研究員仇曉莉指出，從理論上來說，只要有一個精子，就有生育的可能，因為一個胚胎是一個精子和一個卵子結合而成的。因此國內外多個生殖中心的專家們都在奮力研究稀少精子的冷凍技術。目前臨床上稀少精子冷凍技術在一定程度上能夠解決嚴重少、弱、畸精子癥和無精子癥患者的不育問題[10-13]。將嚴重男性不育癥患者的少量精子進行冷凍保存，保護不育男性患者的生育權，使患者在婚后仍能獲得自己健康的后代，從而維護社會穩定和家庭和諧[14]。上海市第一人民醫院李錚教授團隊經過數年的不懈努力，終于在2016年報道了我國第1例單精子冷凍試管嬰兒誕生，目前已有3例活產[15]。

有研究報道與射精的精子相比，通過TESA得到的精子凍融后行ICSI的優質胚胎率差異有統計學意義[16-17]，這與本研究結果一致。本研究結果顯示，冷凍TESA精子組正常受精率、正常卵裂率和優質胚胎率（62.99%，84.83%，34.64%）低于常規ICSI組（82.11%，97.07%，48.29%）和新鮮TESA組（73.18%，91.02%，42.47%），差異有統計學意義（P<0.05）。可能是因為睪丸穿刺手術獲得的精子大多數是微微抖動的精子，這些精子不僅沒有完全發育成熟，而且精子活動能力差;并且冷凍TESA精子經過冷凍和解凍，由于滲透壓變化及冷凍過程對精子細胞膜等的損傷，導致冷凍TESA精子在復蘇后精子的活力和膜功能等受到不同程度的破壞[18]。有研究發現，冷凍復蘇過程會造成精子DNA損傷，影響精子的運動能力和活力及頂體完整性相關蛋白的表達[19]，這可能是影響受精和胚胎發育的主要因素。但是，對于一些非梗阻性無精子癥患者而言，稀少精子冷凍技術目前仍是他們首選且唯一的治療方案[20]。

由于本中心目前對非梗阻性無精子癥患者首先采用經過TESA獲得的新鮮精子行ICSI，故冷凍TESA精子組的樣本量極少，研究存在一定的局限性，目前還沒有妊娠的病例。另有研究分析TESA精子來源于睪丸，沒有經歷精子運輸、獲能等一些正常的生理過程，從而促使形態異常的精子與妊娠丟失直接相關;并且稀少精子凍融后行ICSI后產生的子代安全問題仍需要更多的實驗和臨床深入研究了解，從而為人類的生育力保護事業提供更加有力的支持。

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（收稿日期：2021-04-26）