吡菲尼酮對UUO大鼠腎纖維化組織中TGF-β1/smad3通路表達的影響①

康曉明,楊舒賀,聶 晶,孟慶云,楊 松,楊占雙(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科， 黑龍江 佳木斯 154003)

腎臟纖維化是慢性腎臟疾病終末期過程,其改變包括炎性細胞浸潤，成纖維細胞活化，管周毛細血管損失和腎小管萎縮[1]。Yuan[2]等證明，腎近端小管上皮細胞的線粒體代謝功能障礙參與了上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)病機制。線粒體功能的異常激活凋亡程序是纖維化的重要細胞因子條件。Corcoran[3]等人證明線粒體在腎上皮細胞中具有擴增TGF-β1誘導纖維化，表明線粒體通過調(diào)節(jié)TGF-β1信號轉(zhuǎn)導促進纖維化的進展。目前，纖維化的具體作用機制及相關(guān)通路的探索仍缺乏全面認識及更詳盡的敘述，故本課題意在探討該通路的因子調(diào)節(jié)程序，為研發(fā)抗腎間質(zhì)纖維化的藥物、慢性腎臟疾病的控制及治療具有重要臨床應用意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

雄性Wistar大鼠體重(150±10)g；吡菲尼酮片，兔抗大鼠TGF-β1、smad3多克隆抗體、DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 實驗步驟

72只Wistar雄性大鼠體重隨機均分為3組,行單側(cè)輸尿管結(jié)扎制成UUO模型，分為假手術(shù)組、模型組、吡菲尼酮(500mg/kg·d灌胃),模型組和對照組以等量生理鹽水灌胃；各組大鼠灌胃每日一次。各組大鼠分別在手術(shù)后第3, 7, 14天分批處死。處死前留取靜脈血，留取左側(cè)梗阻腎標本，梗阻腎沿矢狀面用手術(shù)剪小心剖開，腎組織在4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)脫水石蠟包埋，待做HE染色、Masson染色及免疫組織化學等。

1.2.2 生化指標檢測

各組大鼠靜脈血行血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)生化檢測。

1.2.3 HE

各組腎組織經(jīng)切片染色后光鏡下選取10個200倍不同視野，用TLS評分表示損傷程度[4]。

1.2.4 免疫組化

觀察TGF-β1、smad3表達狀況，視野內(nèi)表現(xiàn)為棕黃色的顆粒為染色陽性指標。隨機觀察10個不同視野，利用圖像分析系統(tǒng)分析兩組陽性染色(棕黃色顆粒)的平均光密度，用AOD表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 生化分析

Sham 組鼠血BUN、Scr等生化指標無明顯差異(P>0.05)。UUO模型組大鼠生化指標較sham 組明顯升高，治療組大鼠指標較UUO組各指標降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組生化指標變化

2.2 HE 染色

光鏡下可見Sham組大鼠在第3、7、14d腎臟結(jié)構(gòu)無明顯改變。UUO模型組大鼠隨著時間的增加，腎小管擴張，間質(zhì)可見炎性細胞浸潤，基底膜細胞被大量破壞。治療組基底膜細胞破壞程度及炎性物質(zhì)浸潤程度均較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠不同時間點TIS評分比較分)

2.3 免疫組化

Sham 組TGF-β1及smad3表達較少；UU0組隨梗阻時間的延長表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與UUO組相比，治療組 棕色顆粒表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) 。見表3。

表3 3組大鼠TGF-β1、Smad 3在腎小管表達情況

3 討論

吡菲尼酮(5-甲基-1-苯基-2(1H) - 吡啶酮)已被臨床用于治療各種纖維化疾病[5]。Takakuta[6]等發(fā)現(xiàn)它可抑制TGF-β誘導的纖維連接蛋白的表達。 通過干預體外實驗中大鼠腎臟成纖維細胞，減弱活化和有絲分裂，導致纖維連接蛋白明顯減少。可保留受損腎臟細胞中線粒體嵴結(jié)構(gòu)，減少了腫脹線粒體的出現(xiàn)，起到保護腎臟功能的作用，并且其對線粒體的調(diào)節(jié)機制是通過誘導TGF-β/smads通路實現(xiàn)的[7]。在肝纖維化動物模型中，還可降低TGF-β1 mR N A表達，膠原特異性分子被認為在細胞外基質(zhì)合成和重塑中起重要作用。在腎臟研究中，吡菲尼酮已被證明可通過降低纖溶酶原激活物抑制劑-1表達，誘導TGF-β1對于基質(zhì)的降解作用與本實驗觀察結(jié)果一致。在小鼠系膜細胞中，吡菲尼酮降低TGF-β1啟動子活性，降低蛋白分泌，并調(diào)節(jié)下游Smad通路磷酸化[8]，與本實驗研究結(jié)果一致。

TGF-β1可通過激活Smad依賴性和非依賴性途徑誘導肌成纖維細胞分化來增強成纖維細胞的增殖，遷移和膠原產(chǎn)生能力，導致纖維化的出現(xiàn)。Monique[9]等實驗證實吡菲尼酮治療減弱TGF-β1誘導的Smad2 / 3的磷酸化，與本實驗研究發(fā)現(xiàn)治療組大鼠較UUO組相比TGF-β1及smad3表達較對應時間點減少，結(jié)果一致。

結(jié)合本實驗結(jié)果，證實了TGF-β1/smad3通路在腎間質(zhì)纖維化進展過程中起到重要的作用。其可通過抑制線粒體形態(tài)及功能，進而影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化進程及降解細胞外基質(zhì)等多種途徑影響纖維化。吡菲尼酮可抑制腎小管內(nèi)TGF-β1/smad3通路的表達從而延緩腎纖維化的進程。