富白細胞-富血小板纖維蛋白的凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗研究①

季慶輝, 薛 宇, 姬宇輝, 劉士臣, 喬建民,喬曉峰(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)由于股骨頭受損或血供中斷，產生骨細胞及骨髓成分死亡[1]，導致其結構改變、塌陷、功能障礙疾病，股骨頭缺血性壞死導致患者致殘率非常高，是骨外科常見極難治愈疾病[2]。富白細胞-富血小板纖維蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)凝膠是采集富含白細胞-富含血小板血漿血液放入離心管中離心濃縮制備而成。 L-PRF凝膠是一種含有豐富的自體血小板與白細胞纖維蛋白物[3]，富含血小板的血漿中含有大量(血小板衍生、轉化、類胰島素、表皮、血管內皮)等生長因子及(血纖維蛋白)蛋白質，L-PRF凝膠對成骨細胞有修復愈合促進作用[4]。骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是具有慢周期性、自我更新能力的原始祖或未分化細胞[5]，BMSCs具有支持造血細胞、調節免疫的功能可以與其他干細胞構成結締組織支架，分泌細胞外基質蛋白，調節造血細胞增殖和歸巢[6]。L-PRF凝膠結合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗研究，主要探索L-PRF凝膠結合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死，為臨床治療L-PRF凝膠結合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康正常新西蘭大白兔30只, 雌雄各1/2，4 月齡，體重(2400±300) g, 大白兔由佳木斯大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑與實驗儀器

1.2.1 主要試劑。DMEM/F12(1:1)液體培養基(HyClone,美國猶他州洛根市)，CellMax標準胎牛血清(賽澳美細胞技術(北京)有限公司)，胰蛋白酶(武漢普諾賽生命科技有限公司)，牛凝血酶(上海經科化學科技有限公司)，預染蛋白Marker(北京聚合美生物科技有限公司)，25%戊二醛(上海海曲化工有限公司)，無水乙醇(沈陽薩雷碩化學試劑有限公司)，乙酸異戊酯(蘇州友欣香料化工有限公司)，40%甲酸溶液(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2.2 實驗儀器。SW-CJ系列醫用型超凈工作臺(上海諾萱科學儀器有限公司)，常溫高速離心機(長沙湘銳離心機有限公司)，低溫高速離心機(長沙湘銳離心機有限公司)，-40～-86℃臥式超低溫冰箱(廣州傲雪制冷設備有限公司)，常規手術器械(佳木斯大學臨床醫學院實驗室)，徠卡顯微鏡DM750專業生物顯微鏡(德國，Leica)[7]。

1.3 L-PRF凝膠制備

健康正常新西蘭大白兔股靜脈處采血10mL、放置于無抗凝劑無菌離心管中、3000rpm/min(1408×g)10min、室溫靜置10min、得到3層血液樣本、棄去頂層(淡黃色淡澄清液體)和底層(紅細胞碎片)、取出中間層(淡黃色凝膠)、初級L-PRF凝膠 、靜置干燥無菌容器10min 、無菌紗布吸附釋放血清、L-PRF凝膠[8]。

1.4 BMSCs分離培養

健康正常新西蘭大白兔雙側髂后上嵴穿刺抽取骨髓5mL、加入L一DMEM培養液、制成混合細胞懸液、收集細胞加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋2倍均勻混合、2000rpm/min 20min、取云霧狀中層細胞、100mL/L胎牛血清培養液加入10cm細胞培養皿、2×105云霧狀細胞接種、清除不貼壁造血細胞、純化BMSCS細胞液、調節1×106/mL細胞密度[9]。

1.5 股骨頭缺血性壞死(ANFH)動物模型制備

健康正常新西蘭大白兔長耳邊緣、每次間隔24h靜脈2次注射10μg/kg脂多糖(LPS)、第2次靜脈注射10μg/kg脂多糖(LPS)、新西蘭大白兔臀大肌、每次間隔24h肌注3次10mg/kg地塞米松磷酸鈉、預防感染7d肌注青霉素4.790mg、42d動物模型制備完成[10]。

1.6 L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗動物分組

健康正常新西蘭大白兔30只隨機分為 5 組，每組6只。A：對照組;B：模型組;C：L-PRF組;D：BMSCs組;E：L-PRF+ BMSCs聯合組[11]。

1.7 股骨頭缺血性壞死(ANFH)動物模型修復方法

L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗修復方法，A：對照組。不造模，不處理。B：模型組，模型制成立即將切口縫合。C：L-PRF組，模型制成將50 μg L-PRF凝膠植入缺損區，隨既用骨蠟密閉骨孔，然后立即將切口縫合。D：BMSCs組，模型制成將吸取50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，隨既用骨蠟密閉骨孔，然后立即將切口縫合。E：L-PRF+ BMSCs聯合組。模型制成將50 μg L-PRF凝膠+50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，隨既用骨蠟密閉骨孔，然后立即將切口縫合[12]。

1.8 統計學方法

采用SPSS20.0進行平均數和標準差分析處理。

2 結果

2.1 L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗各組病理組織學觀察

通過病理組織學觀察L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗各組股骨頭壞死發展及修復情況[13],見表1。

表1 L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗修復組織情況

2.2 L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗各組分別三個時間點新生骨面積百分比比較

L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗各組分別在 14d、28d、56d 進行新生骨面積百分比比較，也就是用新生骨面積與缺損區面積進行對比得出百分比，然后進行不同處理修復效果比較。A對照組：不造模，不處理不影響新生骨面積；B模型組：造模，切口縫合處理新生骨面積百分比顯著下降(P<0.05)；C L-PRF組：50 μg L-PRF凝膠植入缺損區，切口縫合處理、D BMSCs組：50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，切口縫合處理、E L-PRF+ BMSCs聯合組：50 μg L-PRF凝膠+50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，切口縫合處理三組新生骨面積百分比均明顯上升，其中EL-PRF+ BMSCs聯合組上升顯著。L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗不同時間新生骨面積百分比比較,見表2。

表2 L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗不同時間新生骨面積百分比比較

2.3 L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗骨陷窩空缺率比較

骨組織由骨細胞與纖維和細胞基質三部分組成，骨細胞在骨細胞基質占橢圓形小腔稱為骨陷窩，通過L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗觀察骨陷窩空缺率可以比較修復效果。

A對照組：不造模，不處理不影響骨陷窩；B模型組：造模，切口縫合處理顯著增加骨陷窩空缺率(P<0.05)；C L-PRF組：50 μg L-PRF凝膠植入缺損區，切口縫合處理、D BMSCs組：50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，切口縫合處理、E L-PRF+ BMSCs聯合組：50 μg L-PRF凝膠+50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，切口縫合處理三組骨陷窩空缺率均明顯下降，其中E L-PRF+ BMSCs聯合組下降顯著。L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗骨陷窩空缺率,見表3。

表3 L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死實驗骨陷窩空缺率(%)

3 討論

股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)分為創傷和非創傷兩大類。創傷和非創傷兩大類股骨頭缺血性壞死引起主要原因：(1)創傷性主要由①股骨頸骨折、②髖關節脫位、③髖部外傷三種創傷引起；(2)非創傷性主要由①應用皮質類固醇、②酗酒二種原因引起。臨床表現：(1)早期癥狀不典型，主要表現是髖關節疼痛；(2)晚期癥狀主要表現①股骨頭塌陷、②髖關節脫位、③Allis征、④單腿獨立試驗征陽性四方面。臨床檢查方法：臨床檢查主要方法①臨床檢查、②X線攝片、③MRI掃描、④核素掃描、⑤CT檢查五種方法。診斷：主要包括①主要標準、②次要標準、③其他三方面。手術治療：主要包括①股骨頭髓芯減壓術、②帶血管自體骨移植、③不帶血管骨移植、④截骨術、⑤人工關節置換術5種方法。

富白細胞-富血小板纖維蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)凝膠是固態可以形成立體網狀結構降解緩慢發揮作用時間長，在創傷部位可以促進修復愈合。L-PRF是一種含有豐富的自體血小板與白細胞纖維蛋白物，富含血小板的血漿中含有大量(血小板衍生、轉化、類胰島素、表皮、血管內皮)等生長因子及(血纖維蛋白)蛋白質，L-PRF凝膠對成骨細胞有修復愈合促進作用，L-PRF凝膠具有接近生理狀態特點促進組織再生生物學性能[14]。

骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)來源廣泛易于分離培養，具有較強分化潛能和可自體移植特點。BMSCs與其它間充質干細胞構成結締組織支架，具有防止免疫移植失敗和免疫調節作用。BMSCS可以多向分化為成骨細胞等也就是具有可塑性，BMSCS自體移植能夠重新形成修復關節面[15]。

實驗研究L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死不同時間新生骨面積百分比比較，A對照組：不造模，不處理不影響新生骨面積；B模型組：造模，切口縫合處理新生骨面積百分比顯著下降(P<0.05)；C L-PRF組：50 μg L-PRF凝膠植入缺損區，切口縫合處理、D BMSCs組：50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，切口縫合處理、E L-PRF+ BMSCs聯合組：50 μg L-PRF凝膠+50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，切口縫合處理三組新生骨面積百分比均明顯上升，其中EL-PRF+ BMSCs聯合組上升顯著。

實驗研究L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死骨陷窩空缺率比較，A對照組：不造模，不處理不影響骨陷窩；B模型組：造模，切口縫合處理顯著增加骨陷窩空缺率(P<0.05)；C L-PRF組：50 μg L-PRF凝膠植入缺損區，切口縫合處理、D BMSCs組：50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，切口縫合處理、E L-PRF+ BMSCs聯合組：50 μg L-PRF凝膠+50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液植入缺損區，切口縫合處理三組骨陷窩空缺率均明顯下降，其中E L-PRF+ BMSCs聯合組下降顯著。

實驗結果證實L-PRF凝膠聯合BMSCs修復股骨頭缺血性壞死三種修復處理L-PRF凝膠與BMSCs和L-PRF+ BMSCs聯合均有效果，其中以L-PRF+ BMSCs聯合修復股骨頭缺血性壞死效果最佳。