MMP-9在慢性缺氧大鼠血漿中表達(dá)及唐古特青蘭的保護(hù)作用①

李 欣,初而復(fù)，盧均坤(.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科, 黑龍江 佳木斯 54003;2.黑龍江省醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 50000)

慢性缺氧能引起人體發(fā)生多種不良反應(yīng)，包括循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多種系統(tǒng)臟器損傷，其中以循環(huán)系統(tǒng)中心臟損傷對(duì)機(jī)體造成的損傷最嚴(yán)重，慢性缺氧能導(dǎo)致心肌組織發(fā)生纖維化，進(jìn)而引起心肌重塑，從而影響心功能。慢性缺氧可導(dǎo)致肺心病、冠心病等多種循環(huán)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)[1]，慢性缺氧所致心肌組織纖維化發(fā)生的機(jī)制主要與慢性缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞外間質(zhì)膠原過(guò)度沉積及心肌細(xì)胞各型膠原比例失調(diào)密切相關(guān)。MMP-9是一種肽鏈內(nèi)切酶，具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞各型膠原比例及降解心肌細(xì)胞外膠原基質(zhì)成分的作用。但目前對(duì)于慢性缺氧所致血漿中MMP-9表達(dá)量變化的影響及其機(jī)制的研究，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較少。

目前，藏藥唐古特青蘭的生理學(xué)作用日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視。目前各方面研究主要集中在對(duì)唐古特青蘭治療消化系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾病等方面所起作用機(jī)制的研究[2]，但關(guān)于唐古特青蘭保護(hù)心肌組織機(jī)制的研究較少，唐古特青蘭保護(hù)心肌組織的機(jī)制與途徑目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建慢性缺氧所致心肌損傷的模型，應(yīng)用唐古特青蘭對(duì)已發(fā)生心肌損傷的模型進(jìn)行干預(yù)，從而進(jìn)一步研究MMP-9、BNP在唐古特青蘭干預(yù)慢性缺氧所致心肌損傷中的表達(dá)情況并深入探討唐古特青蘭對(duì)慢性缺氧所致心肌損傷的保護(hù)作用的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量170～210g，共60只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

血漿BNP、MMP-9 ELISA試劑盒由美國(guó)R&D公司進(jìn)口，上海活樂生物有限責(zé)任公司提供。

1.3 動(dòng)物模型的建立

將60只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組20只，分別標(biāo)記為對(duì)照組(A組)、慢性缺氧損傷+唐古特青蘭干預(yù)組(B組)、慢性缺氧損傷組(C組)，B組大鼠經(jīng)腹腔注射2g/kg的唐古特青蘭(純化浸膏), A組和C組則注射等量的生理鹽水注射液。給藥24h后,將B組和C組大鼠放入乏氧動(dòng)物飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng),通入氮氧混合氣體(N2∶O2=90∶10),測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)乏氧箱內(nèi)氧濃度, 乏氧箱內(nèi)放置氯化鈣和鈉石灰吸收箱內(nèi)CO2和H2O，8h后將大鼠取出, 置于常氧動(dòng)物飼養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng),第2天重復(fù)以上過(guò)程,共持續(xù)2W。

1.4 檢測(cè)BNP、MMP-9

應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法, 腹主動(dòng)脈采血，靜置0.5h后3000r/min離心20min，取離心管上層血漿置于EP管中，放入-80℃電冰箱內(nèi)儲(chǔ)存。用血漿BNP、MMP-9 ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血漿中BNP、MMP-9濃度，操作過(guò)程及步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

B組大鼠血漿中BNP及MMP-9表達(dá)量均顯著低于C組(P<0.05)，而明顯高于A組(P<0.05)，MMP-9與BNP呈正相關(guān) (rA=0.823, rB=0.805，rC=0.727)，見表1。

表1 給藥2周后各組大鼠BNP及MMP-9比較

3 討論

心肌組織是機(jī)體內(nèi)對(duì)慢性缺氧十分敏感的器官。慢性缺氧可通過(guò)多種途徑導(dǎo)致心肌組織代謝異常、引起心功能下降，慢性缺氧所致的心肌組織損傷是多種循環(huán)系統(tǒng)疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中重要的病理生理改變途徑之一，在成年人多見于肺心病、冠心病等慢性缺氧性疾病;在兒童則多見于多種類型的紫紺型先天性心臟病等。慢性缺氧可通過(guò)多種機(jī)制與途徑作用于心肌組織，對(duì)心功能造成一系列影響。慢性缺氧可直接作用于心血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞,使心臟大血管呈收縮狀態(tài)、使血管內(nèi)血流阻力增加;同時(shí)，慢性缺氧也能使機(jī)體內(nèi)醛固酮、血管緊張素和內(nèi)皮素等含量升高，上述多種介質(zhì)作用于肺組織,導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮增厚、平滑肌增生,導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力增高，從而導(dǎo)致肺心病出現(xiàn)，嚴(yán)重影響心功能[3]。近年來(lái)有研究表明，慢性缺氧主要影響右心室的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致右心室心肌組織發(fā)生纖維化，心肌組織纖維化是以心肌細(xì)胞外間質(zhì)膠原過(guò)度沉積、各型膠原比例失調(diào)為主要特征，是多種循環(huán)系統(tǒng)疾病發(fā)生與發(fā)展的主要作用機(jī)制[4]。并且心肌組織發(fā)生纖維化的過(guò)程是心肌結(jié)構(gòu)重塑過(guò)程中心功能由代償期進(jìn)展為失代償期過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一。有學(xué)者認(rèn)為，慢性缺氧能導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓持續(xù)升高，右心室壓力負(fù)荷升高，進(jìn)而引起右心室心肌細(xì)胞肥大、結(jié)構(gòu)重塑、心腔擴(kuò)大。也有研究表明，當(dāng)全心同時(shí)處于慢性缺氧狀態(tài)時(shí)，僅右心室心肌組織受影響而發(fā)生纖維化，而其它心腔的心肌組織并不發(fā)生纖維化，這說(shuō)明并非慢性缺氧直接作用于心肌組織產(chǎn)生的結(jié)果;并且慢性缺氧僅引起肺動(dòng)脈壓力呈增高狀態(tài)，而心臟其它大動(dòng)脈及全身大動(dòng)脈壓力并無(wú)明顯增高。也有研究表明，處于慢性缺氧狀態(tài)下飼養(yǎng)的大鼠右心室收縮壓與右心室心肌組織膠原含量及右心室心肌組織內(nèi)Ⅰ/Ⅲ型膠原比例呈顯著正相關(guān)性[5]。目前認(rèn)為，慢性缺氧所致心肌組織內(nèi)膠原代謝障礙是引起右心室心肌組織發(fā)生纖維化的主要原因。

MMPs是一類Zn2+依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，首先以無(wú)活性的酶原形式分泌，經(jīng)多種激活途徑激活后成為有活性的內(nèi)切酶，發(fā)揮水解蛋白質(zhì)及降解細(xì)胞外基質(zhì)膠原的作用。MMPs家族中重要成員：MMP-9，其前體能由血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、癌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞所分泌，被相關(guān)蛋白酶系水解激活后，成為有活性的MMP-9，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、組織重塑、創(chuàng)傷修復(fù)及炎癥因子的表達(dá)等多種生理過(guò)程[6]。人MMP-9的表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生原始調(diào)控，其啟動(dòng)子的反應(yīng)元件是多種因素誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)的最終靶點(diǎn)。MMP-9的蛋白組學(xué)構(gòu)成包括催化域(包含Zn2+結(jié)合位點(diǎn))、功能域(類纖維黏連蛋白樣功能)和Ⅴ型膠原樣功能域。其中MMP-9具有獨(dú)特的Ⅴ型膠原樣功能域，而MMPs家族中其他成員則不具有該功能域，其中MMP-9前肽序列在其酶原被激活過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。MMPs家族中多種內(nèi)切酶均具有降解心肌組織內(nèi)Ⅳ型膠原的作用，但以MMP-9的降解作用最為重要、調(diào)控途徑也最為精細(xì)。在正常成人體內(nèi)，MMP-9呈低表達(dá)狀態(tài)，但在一些特定的病理生理過(guò)程中可呈高表達(dá)狀態(tài)[8]。但目前關(guān)于MMP-9的表達(dá)與慢性缺氧所致心肌損傷之間相關(guān)性的研究報(bào)道較少。

BNP是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中的一個(gè)重要因素，在心室肌牽張及心室后負(fù)荷增加時(shí)其由心室釋放入血，BNP不僅具有排鈉、利尿、擴(kuò)張血管等作用，還能抑制RASS激活、抑制交感神經(jīng)興奮[9]。關(guān)于心肌慢性缺氧導(dǎo)致BNP合成與分泌調(diào)節(jié)機(jī)制的研究較少，耿旭等[10]研究表明，BNP的合成與分泌與心室容積及心室壁所受張力大小無(wú)關(guān)，慢性缺氧可直接作用于機(jī)體心肌組織，導(dǎo)致心肌組織BNP合成并分泌入血。Wen[11]等研究發(fā)現(xiàn)，在慢性缺血缺氧條件下，白細(xì)胞介素6首先被激活，進(jìn)而啟動(dòng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad2信號(hào),從而參與BNP的合成。目前認(rèn)為，在BNP的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，多種炎性細(xì)胞因子參與其中，HIF-1α及其類似物扮演重要角色，并可能在未來(lái)心肌急慢性缺血缺氧的基因治療中發(fā)揮重要作用[12]，而BNP與慢性缺氧時(shí)的心肌纖維化關(guān)系的相關(guān)研究目前較少。

藏藥唐古特青蘭又名甘青青蘭，主要含有黃酮甙、胡蘿卜甙、脂類、氨基酸等。研究發(fā)現(xiàn)，唐古特青蘭純化物具有降低動(dòng)物機(jī)體氧耗、保證缺氧狀態(tài)下能量代謝等作用，對(duì)組織長(zhǎng)期慢性缺氧具有明顯的干預(yù)與保護(hù)作用[13,14]。但唐古特青蘭對(duì)慢性缺氧所致大鼠心肌損傷模型的保護(hù)作用及其機(jī)制方面的研究目前報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立慢性缺氧SD大鼠模型，應(yīng)用ELISA法，研究藏藥唐古特青蘭對(duì)慢性缺氧大鼠血清BNP、MMP-9表達(dá)量的影響，為我國(guó)藏藥治療慢性缺氧所致的多種心臟疾病提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)BNP、MMP-9 ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血漿BNP、MMP-9表達(dá)量，結(jié)果顯示，B組大鼠血漿BNP表達(dá)量明顯低于C組(P<0.05)，而明顯高于A組(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在體內(nèi)模型中，正常心肌組織分泌少量BNP及MMP-9，慢性缺氧時(shí)BNP及MMP-9分泌增加，但當(dāng)加入一定濃度的唐古特青蘭后，會(huì)減少慢性缺氧的心肌組織BNP及MMP-9分泌量，這表明唐古特青蘭對(duì)慢性缺氧所引起的心肌細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，同時(shí)也說(shuō)明雖然唐古特青蘭具有明確的保護(hù)作用，但其并不能將受損的心肌細(xì)胞完全恢復(fù)至正常，這可能受到唐古特青蘭濃度及慢性缺氧作用時(shí)間的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建慢性缺氧所致大鼠心肌損傷的體內(nèi)模型，使用唐古特青蘭對(duì)已發(fā)生心肌損傷的動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)，研究結(jié)果表明藏藥唐古特青蘭對(duì)慢性缺氧所致SD大鼠損傷的心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用是否是通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物模型體內(nèi)的BNP、MMP-9表達(dá)情況來(lái)發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)揭示了慢性缺氧在機(jī)體內(nèi)對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷的機(jī)制及唐古特青蘭在體內(nèi)對(duì)抗慢性缺氧所引起心肌細(xì)胞損傷的主要途徑，為進(jìn)一步研究MMP-9在唐古特青蘭干預(yù)慢性缺氧所致心肌損傷中的表達(dá)情況，及深入探討唐古特青蘭對(duì)慢性缺氧所致心肌損傷的保護(hù)作用及其具體機(jī)制提供了新的科研思路，為今后慢性缺氧所致心臟疾病的靶基因治療提供理論依據(jù)。