多肽介導腫瘤靶向納米粒載體的制備及其特性

吳巖，宮春愛，王偉宏

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，上海201999

腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一，化療在腫瘤的治療中發揮重要作用，但部分患者化療效果不理想，且化療對患者的傷害較大，這是腫瘤治療的難點［1-2］。造成這種現象的主要原因是藥物對腫瘤組織缺乏選擇性，殺傷腫瘤細胞的同時也損傷了正常細胞。腫瘤靶向治療效果優于傳統化療，并且毒副反應低。因此，腫瘤靶向藥物遞送系統的研究備受關注［3-5］。為滿足臨床需要，2019 年 6 月—2020 年6 月我們制備了一種具有腫瘤微環境敏感的硫辛酸（LA）修飾的多肽載體，多肽序列為LA-K-L2-G2-R8（LA-KR），通過該載體將抗腫瘤藥物準確遞送至腫瘤細胞，從而增強藥效，減少毒副反應。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 乳腺癌細胞（MDA-MB-231，中國科學院上海分院），多肽單體合成（上海強耀生物科技有限公司），羧基熒光素標記的小干擾RNA（FAM-siRNA，上海暢碩生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術研究所），胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司），半胱氨酸和硫辛酸（上海生工生物工程股份有限公司），甲醇等其他試劑為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。核磁共振譜儀（400-Plus，美國 Varian 公司），粒度電位分析儀（ZS90，英國馬爾文儀器有限公司），流式細胞儀（FACSCalibur，美國BD 公司），磁力攪拌器（B11-2型，上海司樂儀器有限公司），透射電鏡（日本HITA?CHI公司）。

1.2 納米粒載體的制備及多肽載體結構鑒定 將多肽單體溶于甲醇中，利用30%半胱氨酸鹽酸鹽作為交聯劑，磁力攪拌12 h后吹干甲醇，得到半胱氨酸交聯后的硫辛酸多肽載體（LA-KRss）；取20 mg LAKRss 溶于1 mL 二氯甲烷中，加入去離子水8 mL，冰浴超聲30 s，功率200 W。將溶液倒入盛有10 mL 去離子水的燒杯中，磁力攪拌揮發2 h 即得納米粒載體。將LA-KRss 溶于重水，用600 MHz 磁共振氫譜儀鑒定LA-KRss結構。

1.3 納米粒載體基本表征檢測 利用透射電子顯微鏡觀察納米粒載體形態和均勻度，粒度電位分析儀檢測納米粒載體粒徑及表面電位。

1.4 納米粒載體臨界膠束濃度篩選 按照1.2 制備空白納米粒膠束溶液，配制1 mg/mL 膠束溶液。用芘作為熒光探針，在含有微量芘的容量瓶中配制各濃度的膠束溶液，用熒光光度計檢測波長373 nm（I1）和383 nm（I3）的熒光度值，以空白載體濃度的對數為橫坐標、I1/I3為縱坐標作圖。

1.5 多肽載體LA-KRss 對FAM-siRNA 包裹能力檢測 采用瓊脂糖凝膠電泳實驗。制備氮（N）/磷（P）值為0、0.5、1、2、3、4、5、10 的LA-KRss/FAM-siRNA，孵育 0.5 h，其中 FAM-siRNA 的加入量均為 1 μg。用TAE 緩沖液（由三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸組成）制備1%瓊脂糖凝膠。將制備好的LA-KRss/FAM-siRNA 加入瓊脂糖凝膠中，設置電壓為100 V，電泳時間30 min，在紫外光下顯像并拍照。同時二硫蘇糖醇（DTT）模擬的還原性條件下多肽載體LA-KRss 對FAM-siRNA 基因藥物的壓縮包裹情況。DTT可模擬腫瘤細胞內高谷胱甘肽的還原性條件。通過與N/P=0 時的條帶對比，判斷LA-KRss 對FAM-siRNA的包裹情況。

1.6 MDA-MB-231 對多肽載體LA-KRss 介導的基因藥物FAM-siRNA 攝取情況檢測 采用流式細胞術。將對數生長期的MDA-MB-231 接種于12 孔板，3×105/孔，培養 24 h，隨機分為對照組、FAM 組、LA組，分別加入空白培養基、FAM-siRNA 1 μg+培養基、LA-KRss+FAM-siRNA 1 μg+培養基。每組設3個復孔。于培養箱繼續培養6 h，用0.25%胰酶消化細胞，收集細胞，離心后重懸于PBS，并加入碘化丙啶染液。利用流式細胞儀檢測，統計各組的熒光密度值。

1.7 納米粒載體對MDA-MB-231 的毒性檢測 采用CCK-8 法。將對數生長期MDA-MB-231 接種于96 孔板，1×104/孔，置于培養箱培養 12 h 后，將不同濃度（5、10、20、40、80、160 μg/mL）納米粒載體溶液加入培養板中，每個濃度設6 個復孔。于培養箱中繼續培養24 h。取出96 孔板，棄掉舊培養基，每孔加入90 μL培養基和10 μL CCK-8溶液，繼續于培養箱中放置1 h，將96 孔板置于酶標儀振蕩30 s，檢測波長450 nm 處各孔的吸光度（OD）值，并計算細胞存活率。細胞存活率=（加藥組OD 值-空白培養基組OD 值）/（空白細胞組OD 值-空白培養基組OD值）×100%。

1.8 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多肽載體LA-KRss 的結構 多肽單體在半胱氨酸的作用下成功聚合。圖譜中各峰歸屬：2.45、2.64及1.36～1.79屬于硫辛酸部分的質子峰，0.80、0.86、2.15 分別屬于亮氨酸中伯碳、仲碳、叔碳上的氫，2.24 屬于羰基亞甲基上的氫，3.58 屬于硫辛酸的甲基；4.17 屬于賴氨酸中接近氨基的-CH2；3.12、3.27、3.71 屬于接近精氨酸叔碳的-CH2-；4.24、3.88屬于聚合物中的叔碳質子峰。

2.2 納米粒載體的基本表征 透射電鏡下觀察到的納米粒載體為圓形，均一性較好，粒徑為（160.6±1.9）nm，電位為（16.3± 0.7）mV。

2.3 納米粒載體的臨界膠束濃度 I1/I3突變點處納米粒濃度即納米粒載體的臨界膠束濃度為0.002 12 mg/mL。

2.4 多肽載體LA-KRss 對FAM-siRNA 的包裹能力 當 N/P 為 0～1 時，FAM-siRNA 不能被多肽載體有效壓縮包裹，在電場作用下可見清晰條帶；N/P=2時，未觀察到明顯條帶，說明FAM-siRNA 在同等電場的作用下并未發生遷移，此時FAM-siRNA 被多肽載體有效包載；在DTT 條件下，N/P=2 時可以看到明顯條帶，多肽載體可在還原性條件下釋放藥物。

2.5 MDA-MB-231 對 FAM-siRNA 的攝取情況 對照組、FAM 組、LA 組光密度值分別為194.7 ± 35.4、363.7 ± 35.6、2 577.3 ± 224.1。LA 組、FAM 組光密度值高于對照組（P均<0.05），LA 組光密度值高于FAM組（P<0.05）。

2.6 納米粒載體對MDA-MB-231 的毒性作用 納米粒載體濃度為 5、10、20、40、80、160 μg/mL 時，細胞存活率分別為（98.3 ± 0.8）%、（97.3 ± 1.2）%、（97.6 ± 2.0）%、（96.1 ± 1.6）%、（95.5 ± 2.2）%、（95.2 ± 2.0）%，比較差異均無統計學意義（P均<0.05）。

3 討論

長期以來傳統的化療藥物在腫瘤的治療中占有重要地位，但因其殺傷細胞的非選擇性，導致了嚴重的毒副反應，限制其臨床應用［6-8］。此外，多數化療藥物的水溶性差也是臨床應用面臨的一個重要問題［9］，如常用化療藥物阿霉素、多西他賽、紫杉醇等，因其水溶性差常被制成不同劑型或通過合適的載藥系統來提高溶解度。隨著各種新型抗腫瘤藥物不斷研發，各種治療手段的應用，綜合治療成為各種癌癥患者更為合理的治療策略。RNAi 可抑制相關癌基因的表達，有可能成為治療腫瘤的新策略。研究表明，RNAi 技術與化療等方法聯合應用，可發揮協同作用，大幅提高抗腫瘤療效［10-11］。但如何構建載體遞送基因藥物，是治療的關鍵環節。

多肽是一種以肽鍵連接多個氨基酸的大分子。作為藥物載體，多肽在體內可被生物降解，具有毒性低、無免疫原性、制備容易等特點。多肽類載體主要是指各種細胞穿膜肽。寡聚精氨酸八肽（R8）是目前最有潛力的細胞穿膜肽。研究發現，5～11 個連續的精氨酸串聯具有顯著的穿透細胞膜的能力，其中R8 最有效［12-13］。R8 具有與 siRNA 及 DNA 靜電相互作用的潛力，并且動物模型研究顯示其無毒性［14-15］。通過對它結構進行改造，使其可同時實現穿透細胞膜及包載基因藥物。本研究通過固相合成法合成了硫辛酸修飾的多肽單體，由于硫辛酸五元環內二硫鍵在半胱氨酸的作用下能發生分子間交聯，進而生成多個多肽單體聚合的載體。該多肽載體在MR 檢查中顯示多肽單體成功聚合。納米粒載體結構中含有疏水性的空腔，能包載疏水性化療藥物，并且可以通過精氨酸的正電性壓縮基因藥物，同時可以響應腫瘤細胞內高谷胱甘肽的還原性條件，進而可以釋放藥物。本研究重點考察了所構建載體遞送基因的應用研究，所構建載體LA-KR 富含帶正電荷的氨基酸，能夠攜帶負電荷的基因藥物，如siRNA，通過該載體的包裹可以解決疏水性抗腫瘤藥物水溶性差的問題。本研究主要考察所構建載體遞送基因藥物的效果，以希望為基因藥物的遞送提供參考。

細胞內部的谷胱甘肽含量很高，而腫瘤細胞內部的谷胱甘肽含量是正常細胞的4 倍［16］。基于腫瘤微環境的這個特點，可以構建腫瘤微環境還原性條件敏感的多肽納米粒載體，載體進入腫瘤細胞后，其二硫鍵結構在谷胱甘肽的作用下會斷裂降解，可以更好地釋放其包載的藥物，發揮藥效［17-19］。硫辛酸的分子結構中含有二硫鍵，其側鏈上的羧基活性較高，能與細胞膜的脂質雙分子層融合，攜帶藥物穿過細胞膜進入細胞內部。有研究表明，硫辛酸修飾的多肽載體可以實現腫瘤微環境敏感釋藥，毒性比較低，生物相容性好［20］。

載體把藥物成功遞送至腫瘤細胞發揮藥效，不僅需要靶向性，還要求載體能夠穿過腫瘤血管內皮間隙（多為380～780 nm），最終到達腫瘤細胞內。因此，載體的粒徑大小至關重要。本研究制備的納米粒載體粒徑為160 nm 左右，可以通過腫瘤血管內皮間隙。為了考察該納米粒載體進入腫瘤細胞的能力，通過流式細胞術檢測細胞攝取情況。結果證實該納米粒載體能夠有效穿透細胞膜進入細胞內，確保將攜帶的藥物載入靶細胞內，發揮抗腫瘤作用。此外，安全性也是藥物載體必須要考察的因素之一。毒性實驗結果表明，該納米粒載體對MDA-MB-231毒性低。

綜上所述，本研究合成的納米粒載體克服了一般載體難以安全降解、攜帶藥物進入細胞內部能力不足、自身毒性、釋藥能力不強等問題，并且增加了疏水性化療藥的溶解度。該納米粒載體細胞毒性低，可以響應腫瘤高谷胱甘肽的微環境，并且能夠穿透細胞膜將其包載藥物帶入細胞內部發揮藥效。此外，該納米粒載體能夠成功壓縮基因藥物，為基因藥物納米遞送載體及腫瘤靶向基因治療提供參考。但本研究只是初步評價了納米粒載體的基本特性，為進一步驗證該載體的應用價值，后續將進行載體包載化療藥物的包封率、載藥量和體外釋放等研究。