DNA甲基化在神經發育及中樞神經系統相關疾病中的作用研究進展

于明懂，于泳浩，李佩，張英立

1天津醫科大學第二醫院，天津 300211；2天津醫科大學總醫院；3天津市天津醫院

表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的情況下，由環境因素的變化引起的基因功能的改變，表觀遺傳機制通過調控使相同基因在不同的細胞類型和背景下差異表達，以決定細胞命運，其表型的變化可以傳遞給后代細胞，而且這種變化是可逆的。表觀遺傳機制主要包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾和核小體定位變化等，其中DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳學修飾方式已成為表觀遺傳學領域的研究熱點，其對基因組的功能調控和穩定性維持具有重要意義［1］。在中樞神經系統，多種非遺傳因素可以通過表觀遺傳學機制來影響突觸的可塑性、記憶的獲取和鞏固、神經通路的連接以及神經信號的傳遞等，DNA甲基化在其中發揮了非常重要的作用。DNA甲基化在胚胎及神經系統發育、神經退行性病變和腦缺血性損傷等疾病的發展過程中都發揮著重要的作用，并已經成為疾病治療過程中藥物作用的靶點。本文旨在對DNA甲基化在神經發育及中樞神經系統相關疾病中的作用進展進行綜述。

1 DNA甲基化及其在中樞神經系統中的功能概述

DNA甲基化是由一系列DNA甲基轉移酶（DNMTs）催化的，它們將一個甲基從S-腺苷蛋氨酸（SAM）轉移到胞嘧啶環的5號碳位上（5mC），通過改變局部染色質的結構來改變基因的表達。DNMTs主要有三種類型，其中DNMT3a和DNMT3b在發育或其他病理生理條件下，能催化雙鏈DNA上未甲基化的基因位點出現新的甲基化，建立新的DNA甲基化模式；而DNMT1能識別半甲基化的DNA，在DNA復制過程中使現有的DNA甲基化模式得以維持。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鳥嘌呤（G）二核苷酸（CpG）上，非CpG甲基化很少見，長度大于200 bp且C和G的含量大于50%的CpG聚集區稱為CpG島。DNA低甲基化發生在CpG島以外的CpG位點，通常與基因激活有關；而DNA高甲基化，主要發生在CpG島的基因啟動子，通常與基因抑制有關。DNA甲基化通過直接抑制轉錄因子與啟動子的結合以及招募DNA甲基結合蛋白來抑制基因表達［2］。

在中樞神經系統，DNMTl表達在有絲分裂后的神經元和神經膠質，主要作用是維持局部的甲基化狀態；DNMT3a主要表達在發展、成熟的神經元，以及少突膠質細胞及星形膠質細胞中，對中樞神經系統的復雜行為學功能起到關鍵作用；DNMT3b則主要表達在胚胎及神經前體細胞，在成熟神經元內表達較少，但對突觸可塑性和記憶形成有一定的調節作用［3］。通常，中樞神經系統內DNA甲基化水平處于動態并相對穩定的狀態，在一些特定的生理情況或者病理狀態下，DNA甲基化的狀態能夠被多種因素影響而發生改變，并造成一些神經功能的改變［2］。

2 DNA甲基化在胚胎發育及神經分化形成過程的作用

在哺乳動物的生命早期，來自父母的大多數DNA甲基化標記被清除，胚胎形成時全基因組DNA處于低甲基化水平，胚胎著床以后DNA甲基化水平迅速恢復并建立新的DNA甲基化模式，甲基化模式的建立依賴于DNMT3a和DNMT3b的催化，并且這些新的DNA甲基化模式在DNMT1的催化作用下保持相對穩定［4］。在胚胎神經母細胞中，通過基因敲除使DNMT1和DNMT3b失活會導致胚胎死亡，而DNMT3a失活的小鼠雖然出生時是健康的，但在出生大約4周時因神經發育缺陷而死亡，這說明DNMTs在胚胎發育的不同時期發揮不同的生理作用，胚胎內神經元的存活依賴DNMT1和DNMT3b，DNMT1在細胞分化和細胞分裂中起關鍵作用，DNMT3b在早期發育過程中必不可少，而DNMT3a能促進神經源性基因的轉錄，進而完成神經元的分化［2］。葉酸能為機體提供DNA甲基化所需要的甲基，孕期補充葉酸不僅可以降低新生兒神經管缺陷的發生率，而且可以提高后代的認知能力。一項研究表明，妊娠期母體葉酸缺乏造成子代個體發生了明顯的DNA甲基化狀態改變，子代雄性大鼠腦組織中有1 939個基因發生了差異甲基化，這些差異基因中很大一部分與神經發育和學習記憶能力相關［5］。

在人類的胎兒大腦發育過程中，DNA甲基化可以調控具有相同基因組的細胞產生不同類型、不同功能的神經元和膠質細胞群體。除了CpG甲基化，DNA的非CpG甲基化也在神經元的發育和成熟過程中發揮關鍵作用。最近的研究發現，在人類胎兒大腦發育過程中，基因組發生了高度動態的低甲基化和高甲基化，并觀察到了幾個顯著的性別特異性基因的甲基化軌跡［6］。DNA甲基化可用于神經發育障礙的預測和診斷，由于早期它在診斷測試中的應用僅局限于少數基因位點，限制了它的應用，但伴隨全基因組甲基化分析（GWMA）方法的使用，更多的基因位點的甲基化變化能夠被準確地檢測，DNA甲基化已經被用于診斷具有明確表觀遺傳特征的，不同基因相關的神經發育障礙［7］，這進一步說明了DNA甲基化在神經發育過程中的重要價值。

3 DNA甲基化在退行性疾病及認知功能障礙中的作用

DNA甲基化異常與許多神經退行性病變有關，其中發病率最高的是阿爾茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。

3.1 AD AD是一種以神經原纖維纏結、淀粉樣β蛋白（Aβ）斑塊沉積和神經元丟失為特征的神經退行性疾病，表現為記憶和認知受損。AD是一種由遺傳因素和環境因素相互作用引起的復雜疾病，具有相似或相同基因的個體在AD的發病率和臨床表現方面的差異，提示表觀遺傳修飾在AD的發病過程中發揮一定的作用［8］。表觀遺傳機制在AD發病過程中的作用已經在細胞系、小鼠模型、死后腦組織和血細胞中得到了廣泛的研究。AD患者大腦中DNMTs表達水平和DNA甲基化水平降低，提示DNA異常甲基化與AD的發病過程有密切的聯系。研究發現，在AD患者的海馬區，以及在功能或結構上與海馬相連的區域（如內嗅覺皮質、顳葉皮質和額葉皮質），DNA甲基化水平均發生了顯著的變化，DNA甲基化水平與海馬區Aβ斑塊和神經原纖維纏結負荷量負相關［9］。

AD的主要病因學假說是淀粉樣變途徑，多種因素可以通過調控與Aβ相關基因的DNA甲基化水平，通過這種途徑來干擾Aβ的沉積或者清除，進而影響其發病。淀粉樣前體蛋白（APP）、β-分泌酶1（BACE1）、早老素1（PSEN1）是Aβ產生過程中的重要參與者，腦啡肽酶（NEP）能催化裂解沉積的Aβ，分揀蛋白相關受體1（SORL1）能促進APP的循環和清除，抑制其在體內的表達。多項研究表明，AD患者大腦皮質或外周血中APP、BACE1、PSEN1、NEP、SORL1啟動子甲基化水平都有顯著的變化，APP、BACE1、PSEN1基因啟動子區域DNA甲基化水平降低，APP外顯子及SORL1啟動子甲基化水平升高［10］。載脂蛋白E（APOE）蛋白在淀粉樣蛋白沉積的形成過程中也起重要作用，APOE的ε4等位基因是晚發性AD最大的遺傳風險因子，AD患者APOE-ε4的甲基化狀態發生了明確的改變。近期的一項研究從AD患者腦內和外周血中提取DNA，使用甲基化陣列進行分析，根據組織類型、疾病狀態、AD相關的生物標志物和基因表達，評估TOMM40-APOE-APOC2區域內甲基化的差異，結果表明DNA甲基化在與APOE相關的發病機制中發揮了作用，并將DNA甲基化作為調節AD患者APOE基因表達的潛在靶點［11］。

AD另一個病理特征為微管相關蛋白tau（MAPT）過度磷酸化導致的神經元纏結，AD患者tau蛋白基因啟動子甲基化狀態發生改變，導致轉錄因子結合啟動子位點的能力改變，并進一步影響tau蛋白的生成和活性。AD患者tau蛋白基因上轉錄激活位點SP1和轉錄抑制位點GCF的甲基化水平隨著年齡的增長顯著降低，造成tau蛋白表達下調和轉錄活性整體下降，另外AD患者蛋白磷酸酶2A的低甲基化可導致tau蛋白異常磷酸化［12］。腦源性神經營養因子（BDNF）是突觸可塑性和記憶形成的關鍵調節因子之一，AD患者BDNF啟動子在海馬等部位發生高甲基化，并伴隨著這些區域BDNF的mRNA和蛋白表達降低，甲基化水平升高與病程呈正相關，而與記憶能力呈負相關［13］。

對DNA甲基化進行調節，可能會恢復年齡依賴性的認知減退，減緩AD的進展。外源性SAM以及營養和膳食化合物，例如葉酸和維生素B，會影響機體DNA甲基化水平，減輕許多與AD相關的危險因素和癥狀。有研究表明，補充葉酸可以顯著改善AD患者的認知功能，血漿中維生素B12水平的升高可以降低癡呆認知障礙或同型半胱氨酸（Hcy）相關癡呆的風險，外源性補充SAM在對抗Aβ誘導的認知障礙，以及年齡相關損傷方面顯示出良好的效果［12］，這些都提示DNA甲基化可作為AD的一個治療靶點。

3.2 PD PD是老年人第二常見的神經退行性疾病，其特征是路易小體的形成、多巴胺能神經元（DAn）功能受損、運動功能下降和認知障礙。α-突觸核蛋白（SNCA）在路易小體的形成中起重要作用，SNCA基因的甲基化水平與SNCA表達之間存在密切聯系，SNCA基因的內含子1（SNCAi1）是一個轉錄活性區域，SNCA發揮作用與SNCAi1的甲基化狀態有關［14］。在PD患者的腦組織和血液中，SNCA的CpG島是低甲基化的，在接受較高劑量左旋多巴的PD患者中發現，其SNCA甲基化水平增加，提示左旋多巴可能是通過DNA甲基化對PD患者發揮作用［15］。多巴胺轉運蛋白（DAT）在多巴胺神經傳遞過程中發揮重要作用，適當調控DAT的表達對維持多巴胺系統內穩態至關重要。DAT1基因是人類DAT的編碼基因，在PD患者的外周血單核細胞中發現，DAT1基因上的特異性CpG位點5′-UTR的甲基化水平顯著升高，這提示DAT1基因的甲基化可能參與了PD進展的過程，然而DAT1基因的甲基化水平能否作為PD生物標志物，特別是其甲基化水平是否與疾病的嚴重程度相關，還需要在更大樣本的實驗中做進一步的研究［16］。

MAPT基因是特發性PD的易感基因，相關研究發現，PD患者異常的MAPT甲基化與發病年齡和疾病狀態有關，MAPT基因啟動子區表現為高甲基化狀態，這種高甲基化狀態能降低tau蛋白的表達，從而起到一定的神經保護作用；研究還發現PD患者的MAPT基因甲基化與性別相關，女性白細胞中MAPT基因甲基化水平明顯高于男性，這可能是女性患PD的風險比男性低的原因之一［17］。PD的發生與炎癥反應密切相關。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種關鍵的炎癥細胞因子，TNF-α的增加與PD中的DAn死亡有關。研究表明在大腦皮層、紋狀體和黑質中，TNF-α基因啟動子中特定CpG島的甲基化水平升高，導致轉錄因子AP-2和SP1的結合減少，并抑制TNF-α啟動子的活性，進而影響TNF-α的表達［18］。

MASLIAH等［19］最早提出PD患者的外周血DNA甲基化模式有望作為PD的生物標志物。近期的一項縱向全基因組甲基化研究，對189例具有典型臨床表現特征的PD患者和191例對照組進行了調查，在疾病初期和隨訪2年之后，共獲得約85萬個CpG位點的甲基化數據，結果顯示PD患者表現出了不同的甲基化模式，PD患者中DNA甲基化是動態的，并隨著疾病進展而改變；常見的PD治療藥物包括左旋多巴制劑和COMT抑制劑，它們都會影響血液中的DNA甲基化模式，說明血液中的DNA甲基化模式可以作為PD患者疾病發展過程中的生物標志物［20］。這為PD的診斷和治療提供了新的思路。

4 DNA甲基化在腦卒中發展過程中的作用

腦卒中是一類可造成腦缺血缺氧損傷的疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中。受多種遺傳和環境因素影響，腦卒中是導致成年人殘疾的主要原因，也是全球人口第二大死亡原因，發病率逐年增高，引起全世界范圍內的關注。然而，其潛在的發病機制尚不完全清楚，表觀遺傳學相關研究的不斷發展可能會為這一領域提供新的見解，有助于進一步理解其病理機制［21］。最早的一項研究顯示，缺血缺氧性腦損傷導致腦內甲基含量增加了3～4倍，表明DNA甲基化在腦缺氧缺血性損傷的發展過程中起重要作用，之后進行了大量的動物實驗和臨床研究，證明DNA甲基化在腦卒中的發病、治療、復發和功能預后等發展過程中發揮著重要的作用［22］。一般來說，腦卒中時DNA甲基化的整體水平較高，并且與大腦中較高的DNMTs活性有關。

Hcy升高是腦卒中確定的危險因素之一，DNA甲基化在血漿Hcy水平升高過程中發揮重要作用。胱硫醚-β-合成酶（CBS）是Hcy轉化為半胱氨酸的主要催化酶，其缺乏可導致高Hcy血癥。在腦卒中患者中，CBS啟動子區甲基化水平升高，這使CBS基因表達水平降低，導致血漿Hcy積聚，增加了腦卒中風險［23］。四氫葉酸還原酶是Hcy降解過程需要的一種酶，其生成由MTHFR基因編碼，腦卒中時MTHFR基因的甲基化水平降低，四氫葉酸還原酶生成減少，導致Hcy水平升高，而MTHFR基因的高甲基化是腦卒中的保護因素，這種保護作用在男性中更加顯著，這些表明MTHFR啟動子甲基化狀態可能在腦卒中中具有診斷價值［24］。腦卒中患者血漿Hcy水平升高也與血栓調節蛋白（TM）基因的DNA高甲基化有關，TM基因作為凝血酶的輔助因子，能降低凝血酶活性，其DNA甲基化升高能抑制TM表達，促進腦卒中的發生［25］。

HLA-DRB1和HLA-DQB1基因與腦卒中的早期神經惡化有關，它們具有調節動脈粥樣硬化斑塊中細胞增殖的功能，這些基因在腦卒中患者中表現為高甲基化，并伴隨基因表達下調，導致動脈中的炎癥反應和動脈斑塊的形成，從而導致了腦卒中病理過程 的 開 始［26］。長 鏈 非 編 碼RNA GAS5（lncRNA GAS5）可調節血管內皮細胞的凋亡，lncRNA GAS5能與絲裂原活化蛋白激酶4（MAP4K4）的啟動子發生相互作用，研究表明，通過抑制MAP4K4啟動子的甲基化，使lncRNA GAS5表達沉默，減少了腦卒中時神經元的凋亡并改善了神經功能［27］。DNA甲基化在腦卒中后疾病復發的過程中也發揮作用，一項對接受抗血小板藥物治療患者的研究表明，腫瘤壞死因子受體相關因子3和蛋白磷酸酶1A的低甲基化升高了中風患者的復發風險［28］。

DNA甲基化干預藥物可用于腦卒中的治療。腦缺血損傷后，腦組織內總體DNA甲基化水平增加，并且與腦損傷的嚴重程度密切相關。在大腦中動脈阻塞大鼠模型中，DNMTs的藥理抑制劑被證明可以降低DNA甲基化水平，縮小梗死范圍，減輕腦缺血損傷［29］。神經元網絡重組是腦損傷后維持神經元功能的主要機制，通過應用DNMTs的抑制劑——5-氮雜-2′-脫氧胞苷進行治療，以降低DNA甲基化水平，可顯著增加腦卒中后健側的紅核、延髓網狀結構和脊髓背外側的交叉纖維數目，并升高健側皮質腦源性神經營養因子的表達水平，從更大程度上促進運動恢復［30］。

研究證明，氨基末端腦鈉肽前體（proBNP）是缺血性卒中短期和長期組織損傷的有效生物標志物，血液中較高水平的proBNP可以預測卒中后1年的長期功能不良結局，BNP編碼基因（NPPB）參與了proBNP在腦卒中時發揮作用的過程，NPPB基因的甲基化水平降低使proBNP的生成增加，NPPB基因啟動子的甲基化水平與腦卒中功能預后顯著相關［31］。根據全血DNA甲基化水平計算出的表觀遺傳年齡在腦卒中患者中比健康人大2.5歲，研究結果表明，與實際年齡相比，表觀遺傳年齡可以更好地預測患者卒中3個月后的功能恢復情況，這提示表觀遺傳年齡可以作為腦卒中后獨立的危險因素，能更好地預測腦卒中的預后情況［22，32］。

5 DNA甲基化在中樞神經系統相關疾病中的應用前景

在人類神經發育及中樞神經系統相關疾病發展過程中，想要獲得更準確的生物學資料往往需要直接獲取組織標本，由于難以從活體受試者獲得大腦樣本，所以通常研究樣本規模較小，限制了相關研究的發展。DNA甲基化在外周血，甚至唾液中都表現出了與大腦的DNA甲基化模式很好的相似性［33-34］，這使得DNA甲基化有望在神經系統相關疾病的預防和診斷過程中能夠發揮更大的作用。另外，由于DNA甲基化是一個可逆的過程，能夠被藥物調控，使其能夠成為神經系統相關疾病治療過程中的藥物靶點，新型的DNA甲基化調節藥物正在逐步問世，有望對相關疾病的治療提供重要的幫助，具有重要的臨床意義。雖然對DNA甲基化的全面研究可能需要更精確的解析，但相信隨著DNA甲基化檢測技術的發展，這一目標最終會得到實現。