線粒體相關內質網膜在腸缺血再灌注損傷中的研究進展

丁可，孫濤，潘銳，景祎馨，張貽幗，孟慶濤

武漢大學人民醫院麻醉科，武漢430060

腸缺血再灌注損傷是由疾病、外科手術等多種原因導致腸組織血供不足，并在恢復血供后損傷反而進一步加重的病理生理過程。腸缺血后再灌注不僅可導致腸道結構和功能改變，還會引起肝、肺、腎等遠隔臟器損傷。腸缺血再灌注后腸上皮細胞經歷缺氧—復氧過程，細胞內氧化應激水平增加，線粒體功能紊亂，三磷酸腺苷（ATP）產生不足，致使活性氧（ROS）在細胞內積聚。此外，腸缺血再灌注后腸黏膜通透性增加，致使腸道內的細菌或毒素進入血液循環，引起全身炎癥反應綜合征，甚至多器官功能障礙綜合征［1］。線粒體相關內質網膜（MAM）是線粒體與內質網之間的動態結構，可調節線粒體和內質網功能。越來越多證據表明，MAM在能量產生、細胞收縮和運動、細胞內外信號傳遞中具有重要作用，能夠參與線粒體ROS產生和積聚、下游炎癥因子釋放、自噬調控、內質網應激以及細胞程序性死亡等生物學過程［2］。近年研究發現，MAM參與的細胞事件和腸缺血再灌注后發生的細胞事件高度重合。因此，了解MAM在細胞內的功能將為腸缺血再灌注損傷治療提供新的方向。本文結合文獻就MAM在腸缺血再灌注損傷中的研究進展作一綜述。

1 MAM概述

SHORE等［3］通過電子顯微鏡觀察發現，線粒體與內質網的共沉淀以及線粒體與內質網囊泡之間的聯系緊密，提出了線粒體與內質網之間存在密切的生物學調控機制。內質網是細胞內信息交流的中轉站，內質網小管是脂質合成和信號傳導的主要區域。線粒體是細胞代謝和細胞程序性死亡等過程中必不可少的細胞器，線粒體變化可影響許多細胞事件的發生和發展。有研究證實，MAM是由內質網和線粒體外膜的膜碎片構成［4］。電子計算機斷層掃描顯示，內質網和線粒體由在光滑內質網大約10 nm處或粗糙內質網大約25 nm處的系鏈相連［5］。內質網—線粒體系鏈結構由多種蛋白質構成，如線粒體融合蛋白（Mfn）、1，4，5-三磷酸肌醇受體（IP3R）、電壓依賴性陰離子通道（VDAC）、葡萄糖調節蛋白75（GRP75）、酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（PTPIP51）、囊泡膜相關蛋白B（VAPB）、PTEN誘導的假定激酶1（PINK1）等［6］。MAM是線粒體和內質網之間形成的物理連接，其形態學和蛋白表達變化會影響線粒體的生物學功能，從而導致神經退行性疾病或代謝性疾病的發生、發展［7］。

2 MAM中參與腸缺血再灌注損傷相關的蛋白質

蛋白質是機體內各種生物學功能的直接執行者。在線粒體和內質網之間的MAM上存在或通過招募各種蛋白質定位到MAM上，從而介導細胞內信號傳導或物質轉運［8］。MAM上的蛋白質在內質網和線粒體之間的物理連接中起直接作用，或調節MAM上的系鏈復合物間接調控生物學功能［6］。在MAM上參與腸缺血再灌注損傷的重要蛋白質或蛋白 質 結 構 有IP3R-GRP75-VDAC、VAPB-PTPIP51、Mfn、FUNDC1、PINK1、BECN1。

2.1 IP3R-GRP75-VDAC 內質網是細胞內Ca2+的存儲場所，能夠通過釋放或回收Ca2+來響應細胞內電刺激或化學刺激。Ca2+介導的信號傳導有利于細胞對外界刺激做出快速反應，從而維持自身的穩態。線粒體是細胞內能量代謝的細胞器，Ca2+則是線粒體氧化呼吸鏈中多種酶的激動劑，能夠決定ATP的生成速度。IP3R是內質網膜上的Ca2+通道，可介導Ca2+從內質網膜上釋放至細胞質和線粒體。VDAC是細胞內最豐富的線粒體外膜通道，能夠調控代謝物進入和流出線粒體，從而廣泛參與調節代謝物和ROS水平以及內質網與線粒體之間的信號傳導。IP3R和VDAC一起介導Ca2+從內質網釋放并轉運至線粒體。VDAC和IP3R通過與GRP75相互作用，調節線粒體和內質網之間的鈣平衡，這是維持線粒體生物能量所必需的［9］。細胞色素C在Bcl-2下游凋亡通路激活后從線粒體內釋放，可與MAM上的IP3R結合，進一步激活Ca2+轉運，從而增強凋亡信號［10］。IP3R-GRP75-VDAC通過促進線粒體Ca2+超載來介導細胞凋亡，而抑制Ca2+從內質網向線粒體轉移的拮抗劑能夠保護小鼠足細胞免于凋亡［11］。VDAC還能與Bcl-2家族的許多促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白相互作用，從而在細胞凋亡中發揮重要作用［12］。VDAC開放還可引起Ca2+大量流入線粒體，使線粒體膜電位增加，從而引起線粒體ROS生成和氧化應激誘導的細胞死亡。在缺血和再灌注過程中，Ca2+超載和細胞凋亡是組織損傷的重要原因。腸缺血再灌注后，通過調控IP3R-GRP75-VDAC，能夠使Ca2+內流減少，避免線粒體Ca2+超載、減少細胞內ROS積聚，在一定程度上減輕腸缺血再灌注損傷。

2.2 VAPB-PTPIP51 VAPB是一種內質網蛋白，富集于MAM上。PTPIP51是一種氨基末端錨定的線粒體外膜蛋白。VAPB與PTPIP51相互作用可促進IP3R/VDAC介導的內質網—線粒體接觸傳遞Ca2+，對于維持線粒體內鈣穩態具有重要作用。MAM被證實是自噬小體生物發生的位點［13］。VAPB或PTPIP51缺失可導致IP3R/VDAC相互作用減少，從而影響線粒體Ca2+攝取，進而刺激自噬發生［14］。敲除VAPB或PTPIP51可導致內質網—線粒體系鏈結構松弛，抑制線粒體與內質網之間的Ca2+交換，從而誘導自噬體形成；而VAPB或PTPIP51過表達則可導致內質網—線粒體系鏈結構更加緊密，MAM的空間距離減小，線粒體與內質網之間的Ca2+交換增加，從而抑制自噬體形成［14］。線粒體自噬是保護線粒體功能、維持細胞內正常能量供應的重要方式。腸缺血再灌注后細胞內自噬水平紊亂，VAPB-PTPIP51通過調節線粒體和內質網之間的距離，增加或減少自噬發生。此外，在siRNA沉默VAPB或PTPIP51的細胞中，使用人工系鏈可以抵消VAPB或PTPIP51沉默對細胞自噬的影響［14］。因此，通過影響VAPB-PTPIP51結構來控制線粒體自噬水平，能夠保護或減輕腸缺血再灌注帶來的組織損傷。

2.3 Mfn 線粒體通過融合和分裂來維持細胞內數量及能量平衡，這種線粒體動態平衡可影響細胞內能量供應和細胞分裂、凋亡以及自噬［15］。線粒體融合使線粒體之間交換一些組分，使有缺陷的線粒體重新獲得呼吸鏈和線粒體DNA的必需成分，從而使細胞免于凋亡并保護線粒體免于自噬。線粒體分裂可影響線粒體網絡的重塑和重排以及線粒體運輸，促進細胞凋亡以及清除功能異常的線粒體。在哺乳動物中，線粒體外膜的融合依靠Mfn，線粒體內膜的融合則由OPA1介導。Mfn包括Mfn1和Mfn2，二者均為線粒體外膜上的跨膜GTPases，它們在相鄰線粒體之間形成復合物并介導外膜融合［16］。Mfn1是線粒體融合的系鏈蛋白，可與OPA1相互作用，從而在線粒體融合中發揮重要作用［17］。GTP能夠觸發Mfn從折疊狀態至展開狀態，兩個線粒體上被GTP激活的Mfn相互靠近可形成反式二聚體結構，從而使相對的線粒體外膜相互靠近，繼而完成線粒體融合［18］。Mfn可以穩定相鄰線粒體之間的相互作用，調節線粒體形態，穩定線粒體和內質網之間的相互聯系。在腸缺血再灌注后，線粒體功能紊亂，Mfn1促進線粒體融合，以修復損傷的線粒體，維持細胞內氧化還原平衡。Mfn2的活性受轉錄調節因子Smad2和鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）、Ras Interactor 1（RIN1）的調控。Smad2是RIN1與Mfn2結合形成復合物的關鍵蛋白，Smad2-RIN1-Mfn2復合物使RIN1充當Mfn2-GTPase活化的GEF，從而促進線粒體融合［19］。Mfn2對線粒體至關重要，在細胞缺少能量，如缺血、缺氧時，能夠維持細胞存活［20］，是腸缺血再灌注后的保護性蛋白。有研究發現，Mfn2缺失可降低心肌細胞對缺血再灌注的反應性死亡，從而降低了鈣依賴性線粒體通透性轉變（MPT）的可能性［21］。MPT是由線粒體通透性過渡孔（mPTP）介導的嚴格調控過程，而mPTP是一種高電導的鈣敏感性通道，在開放時會引起線粒體去極化和功能障礙。在缺血和再灌注期間，mPTP開放導致線粒體膜電位變化，從而影響線粒體ATP生成效率，而嚴重的組織損傷還可導致線粒體DNA（mtDNA）通過mPTP滲漏至細胞質甚至血液，引起局部或全身炎癥反應。因此，調控Mfn表達，穩定線粒體網絡，減少mtDNA滲漏，能夠減輕腸缺血再灌注損傷。

2.4 FUNDC1 MAM不僅是線粒體自噬小體形成的位點，還是線粒體分裂的位點。FUNDC1是一種位于哺乳動物細胞線粒體外膜上的三跨膜蛋白。FUNDC1具有一個與LC3相互作用的區域（LIR），能夠通過與線粒體相互作用并招募LC3，從而介導局部缺血誘導的線粒體自噬。有研究發現，在缺血缺氧過程中FUNDC1會作為線粒體自噬受體在線粒體外膜上表達［22］。線粒體自噬是一種特殊的自噬形式，能夠選擇性地清除受損的線粒體，以應對包括缺氧、ROS積聚和呼吸鏈抑制劑在內的多種刺激［23］，在腸缺血再灌注后清除功能紊亂的線粒體，保證細胞內營養物質的合理利用和能量的正常供應。FUNDC1能夠調節線粒體裂變和線粒體自噬，并介導跨雙膜的偶聯，以此進行線粒體動力學和質量控制［24］。線粒體在被吞噬體吞噬之前需要被碎片化，而線粒體碎片化是線粒體融合和分裂不平衡的結果。在缺血性腦卒中后添加外源性tPA會導致AMPK磷酸化和FUNDC1表達增加，隨后FUNDC1通過LIR與LC3結合，導致自噬雙層膜包裹線粒體，誘導線粒體自噬，從而起到神經元保護作用［25］。腸缺血再灌注后，線粒體外膜上表達FUNDC1的數量決定了線粒體自噬程度，適度線粒體自噬能夠增加細胞對應激的抗性，從而起到臟器保護作用。

2.5 PINK1 在線粒體自噬過程中，自噬體形成需要PINK1。PINK1編碼線粒體蛋白激酶，可調節線粒體形態、運輸功能以及線粒體內Ca2+含量，影響復合體Ⅰ活性和ATP生成。PINK1和E3泛素連接酶Parkin在線粒體質量控制中具有核心作用。當氧化應激、ROS積聚或藥物攝入等原因導致線粒體膜電位受損時，PINK1會在線粒體外膜上穩定表達，招募Parkin、泛素化蛋白和自噬配體蛋白p62向受損線粒體聚集，促使線粒體自噬發生［26］。同樣，在使用線粒體解偶聯劑后亦能觀察到PINK1選擇性地積聚在去極化的線粒體上，促進PARK2移位至線粒體，從而促進線粒體自噬進程。此外，線粒體自噬還能通過PINK1-PRKN依賴性和非依賴性途徑啟動［27］。膜電位受損是腸缺血再灌注后常見的細胞損傷，及時清除膜電位異常的線粒體，增加正常線粒體比例，保持線粒體網絡平衡，能夠有效減輕腸缺血再灌注損傷。

2.6 BECN1 BECN1是Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶（Ptdlns3K）復合物的關鍵成分，是自噬體成核和歐米伽體形成所必需的。在饑餓誘導的自噬中，能夠觀察到Ptdlns3K復合體定位于MAM。PARK2能夠被BECN1招募，重新定位于線粒體上，從而誘導線粒體外膜泛素化和蛋白酶體降解，抑制功能障礙的線粒體融合和運輸。同時，PARK2在被BECN1重新定位后可以使線粒體通過特異性泛素結合受體蛋白與自噬體膜相關聯，隨后與自噬體膜融合，從而完成線粒體自噬過程［27］。BECN1是線粒體自噬過程中必不可少的蛋白質，在BECN1不存在的情況下，PARK2的招募和蛋白酶體介導的線粒體外膜蛋白降解無法有效進行［28］。BECN1是線粒體自噬的關鍵蛋白，可選擇性清除功能障礙的線粒體，在腸缺血再灌注后細胞自我修復中起到關鍵作用。

3 MAM作為腸缺血再灌注損傷潛在的治療靶點

目前，應對腸缺血再灌注損傷最有效的手段是及時恢復缺血部位腸道血供。再灌注雖然可以使腸道恢復血供，但血流再通后誘發的氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、自噬以及線粒體動力學改變，會進一步加重包括腸道在內的多個器官功能損傷。線粒體Ca2+超載、氧化還原穩態失衡、蛋白質錯誤折疊會使線粒體膜通透性改變，線粒體功能障礙、mtDNA漏出，使缺血再灌注后腸道細胞ATP生成減少；mtDNA漏出可激活cGAS-STING通路，從而增強白細胞介素和腫瘤壞死因子轉錄，進一步加重細胞損傷，誘發全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征。抑制MAM上的IP3R或VDAC可通過依賴AMPK的機制誘導自噬，清除受損的線粒體。IP3R-GRP75-VDAC和VAPB-PTPIP51能夠直接影響線粒體內Ca2+含量，在腸缺血再灌注損傷前抑制VAPB-PTPIP51可降低腸缺血再灌注損傷后線粒體Ca2+超載的概率，減少Ca2+導致的線粒體自噬。調控Mfn的功能可以影響線粒體分裂和融合，控制細胞內線粒體的數量和質量，從而滿足細胞的能量需求，清除功能障礙的線粒體，減少mtDNA滲漏，減輕腸缺血再灌注損傷后的炎癥反應，降低全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征的發生率。FUNDC1、PINK1和BECN1是負責線粒體自噬的關鍵蛋白，自噬不足和過度自噬均為組織損傷發生的重要因素，適當增加或抑制這些MAM上的關鍵蛋白可以調控線粒體自噬在一個適當的水平，起到腸缺血再灌注損傷后的臟器保護作用。

綜上所述，MAM上的關鍵蛋白IP3R-GRP75-VDAC、VAPB-PTPIP51、Mfn、FUNDC1、PINK1、BECN1等，能夠參與Ca2+信號傳導、脂質轉移、線粒體網絡動態變化、線粒體自噬、線粒體膜孔道開放和內質網應激反應等。腸缺血再灌注后，腸道細胞內穩態被打破，Ca2+失衡、脂質氧化、線粒體網絡失衡，自噬紊亂、線粒體膜孔道開放以及內質網應激反應發生等。MAM調控的線粒體事件與腸缺血再灌注后的病理生理變化高度重合。因此，通過調控MAM上蛋白表達變化，能夠減輕細胞缺血、缺氧引起的氧化應激，增加細胞對線粒體功能的保護，從而減輕腸缺血再灌注損傷，降低患者死亡率。