棉花根際土壤真菌分離及黃萎病菌拮抗菌的篩選

郝海婷 牛冬冬 阿依妮薩·阿卜力海提 代先興唐澤文 李 猛 武 剛

（1塔里木大學植物科學學院/南疆農業有害生物綜合治理兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

（2南京農業大學植物保護學院，江蘇 南京 210095）

（3新疆生產建設兵團第一師農業科學研究所，新疆 阿拉爾 843300）

棉花是我國重要的一種經濟作物。新疆棉花總產量已連續20多年位居全國第一位[1]。隨著種植面積的不斷擴大和連作種植，土傳病害發生嚴重，尤其是由大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病是棉花主產區的重要病害，已嚴重影響棉花的產量和品質[2-3]。

一直以來，棉花黃萎病的防治比較困難，尚未找到根治的有效防治方法。當前，在新疆地區，棉花黃萎病的防治大多采取“預防為主，綜合防治”的植保策略，主要通過種植抗病、耐病品種以及結合輪作、深翻等措施控制棉花黃萎病蔓延[4-5]。近年來，土壤消毒、種子消毒以及生物防治等手段逐漸在棉花黃萎病病害防治中開始應用[5-6]。

生物防治既符合人們對綠色環保的需求，又可為農業可持續發展提供保障，現已成為防治植物病害的研究熱點。生物防治方法中，利用有益微生物防治各種植物病害是切實可行的策略之一[7]。對植物病害有拮抗效果的有益微生物包括真菌、細菌和放線菌。拮抗真菌大多存在于植物根系和葉圍，對植物有著很好的親合性，在作物上定植，生防效果穩定，拮抗菌分泌次級代謝產物，通過直接或間接的方式，達到阻礙或殺死病原菌的效果[8-9]。因此，尋找環境中高效、多功能的生防微生物是目前棉花黃萎病防治的發展方向[10]。

本研究通過對田間3株健康棉花的根際土壤真菌進行分離和純化，利用皿內對峙方法篩選對棉花黃萎病菌有抑制效果的拮抗菌，并利用分子方法鑒定菌種，明確其種屬地位，為研制防治棉花黃萎病的高效綠色微生物制劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土壤拮抗真菌的分離、純化、形態觀察

棉花品種為新陸中37。選取棉田3個不同點分別取棉花根際土樣，每個點選擇一株健康棉花根際土壤。棉花根際土樣真菌分離采用稀釋平板法。具體步驟為：取棉花根際土樣5 g，懸浮于45 ml無菌水中，在水平搖床上以80 rpm、25℃條件下振蕩培養20 min，即得懸液，并以此稀釋至10-5倍。采用PDA培養基，用移液器分別取土壤稀釋液0.1 mL涂布于PDA培養基平板上，25℃培養4～5 d，選取生長良好的菌落繼續純化3次，觀察記錄。

1.2 棉花根際土壤微生物DNA提取

一種快速提取DNA的方法，具體步驟如下所示。第一步：無菌條件下，用無菌槍頭挑純化好的菌絲到1.5 mL離心管；第二步：加入50 uL 10*TE buffer溶液，振蕩分散菌絲；第三步：封口，微波爐700 W 2 min；第四步：取出立即冰浴2 min，然后離心10 min；第五步：移液器緩慢取10 uL上清液作為PCR模板。

1.3 拮抗真菌的分子鑒定

以提取DNA為模板進行rDNA-ITS、EF-1α、βtubulin和ACT基因測序，在NCBI網站進行Blast比對，選取序列同源性比較值較高的作為參考菌株，評估物種的相似度。所用引物序列見表1。

PCR反應體系為25 uL：DNA模板1 uL，2×Es Taq Master Mix12.5 uL，引物-F0.3 uL，引物-R0.3 uL，ddH2O 10.9 uL。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 抑菌實驗

通過平板對峙法測定分離真菌對大麗輪枝菌的拮抗效果，具體步驟：在新鮮固體PDA培養皿正中間用記號筆分別在距離點2.5 cm左右兩側同一水平線上做標記；用8 mm無菌打孔器在大麗輪枝菌培養皿邊緣打孔，菌餅菌絲面朝下放入PDA左側標記處，封口，放入28℃培養箱中培養5～7 d（大麗輪枝菌生長緩慢）；生長5～7 d的大麗輪枝菌培養基另一端加入純化后的分離真菌，同樣用8 mm無菌打孔器打孔，菌餅菌絲面朝下放入，28℃培養箱中培養，直至產生抑菌圈；對照是在新鮮固體PDA培養皿左側標記點打上8 mm大麗輪枝菌菌餅，右側標記點打8 mm PDA空白菌餅，放入28℃培養箱培養；每個實驗三個生物學重復。

表1 所用引物序列及其來源

計算抑菌率：抑菌率=（對照組真菌菌落生長直徑-處理組真菌菌落生長直徑）/對照組真菌菌落生長直徑×100%。抑菌率數值越高說明抑菌作用越強，拮抗效果越好。

1.5 數據處理

使用Excel對數據進行處理；使用Bioedit進行序列整理，進一步在NCBI上比對。

2 結果與分析

2.1 棉花根際土壤真菌的分離情況

采用稀釋平板法進行菌株的分離與純化，從3份土壤樣本中分離獲得若干菌株，針對這些分離真菌的菌落形態特征進行初步判斷，將這些菌株分為3大類。第一類菌株包括C11，菌株C11接種至PDA培養基中，培養5 d后，菌落正面呈白色，背面呈淡黃色，邊緣菌絲形狀不規則（圖1：A和B）；第二類菌株包括C41、A21和C421，菌落呈波浪狀或高山狀，氣生菌絲呈白色，且輻射狀蔓延，有的菌株有白色菌絲隆起，7 d后菌絲幾乎鋪滿整個培養皿，基內菌絲多層重疊（圖 1：C和 D）；第三類菌株包括 B11、B51、C31和C91，菌落正面呈白色，5 d左右后背面呈淡粉色，菌絲發達，絨毛狀（圖1：E和F）。

圖1 代表菌株菌落形態圖

2.2 棉花黃萎病拮抗菌的篩選

采用皿內對峙法對分離真菌進行抑菌試驗（見表2、圖2）。結果顯示，與對照相比，分離出的每株真菌都對棉花黃萎病菌有一定的抑制作用，抑菌率為29.51%～42.86%，說明這些菌可能產生了具有抑制棉花黃萎病菌活性的代謝產物。

表2 棉花根際土壤分離真菌對棉花黃萎病菌的抑制效果

圖2 棉花根際土壤分離真菌對棉花黃萎病菌菌絲生長的抑制作用

2.3 棉花根際土壤真菌的分子生物學鑒定結果

采用通用引物ITS1和ITS4，擴增8株菌株，得到的片段長度為570～680 bp之間（見表3）；分別采用EF-1α、β-tubulin和ACT基因擴增根際土壤真菌，擴增片段范圍分別為 216～229 bp、329～439 bp和 268～274 bp。

將測序結果進一步和NCBI上的基因序列進行比對（表3），結果表明：分離獲得的B11菌，其ITS序列與粉紅粘帚霉Clonostachys rosea菌株的ITS序列同源性為99.83%（登錄號KX058045.1）、EF-1α序列與C.rosea菌株同源性為97.99%（登錄號MK752496.1）、β-tubulin序列與C.rosea菌株同源性為98.07%（登錄號KJ413352.1）、Actin序列與C.rosea菌株同源性為98.85%（登錄號MH102067.1）。分離獲得的B51菌，其ITS序列與粉紅粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性為99.82%（登錄號MT845995.1）、EF-1α序列與C.rosea菌株同源性為98.01%（登錄號MK752496.1）、β-tubulin序列與C.rosea菌株同源性為98.37%（登錄號AF358166.1）。分離獲得的C31菌，其ITS序列與粉紅粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性為99.83%（登錄號 KX058045.1）、EF-1α序列與C.rosea菌株同源性為97.99%（登錄號MK752496.1）、β-tubulin序列與C.rosea菌株同源性為96.90%（登錄號KJ413352.1）、Actin序列與C.rosea菌株同源性為99.23%（登錄號MH102067.1）。分離獲得的C91菌，其ITS序列與粉紅粘帚霉C.rosea菌株的ITS序列同源性為 99.83%（登錄號KX058045.1）、EF-1α序列與C.rosea菌株同源性為99.49%（登錄號MT462122.1）、β-tubulin序列與C.rosea菌株同源性為97.83%（登錄號KJ413352.1）。

分離獲得的C11菌，其ITS序列與球毛殼菌Chaetomium globosum菌株的ITS序列同源性為100.00%（登錄號MN809366.1）；C41、A21和C421菌株，其ITS序列與高山被孢霉Mortierella alpina菌株的ITS序列同源性分別為99.41%（登錄號MF093212.1）、99.71%（登錄號KX343169.1）和99.56%（登錄號MT453270.1）。

根據分子研究結果，結合形態學的初步鑒定，該8株菌中B11、B51、C31和C91為C.rosea，歸屬于真菌界，半知菌門，叢梗孢科，粘帚霉屬；C41、A21和C421為M.alpina，歸屬于真菌界，接合菌門，被孢霉科，被孢霉屬；C11菌株為C.globosum，歸屬于真菌界，子囊菌門，毛殼科，毛殼屬。

表3 棉花根際土壤真菌的rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin和ACT序列相似性分析

3 討論與結論

粉紅粘帚霉是重要的生防真菌，具有生長速度快、產孢量大、拮抗能力強等多種優點，除了對病原菌有重寄生、抗生、溶菌、競爭作用外，還能誘導植物產生系統抗性[11]，有良好的開發和應用價值。高航等[12]研究發現粉紅粘帚霉有較強的寄生能力，對林果枝干病害病原菌抑制率達60%以上；趙士振等[13]研究發現粉紅粘帚霉對果蔬灰霉病有很好的防效，能有效的寄生灰霉菌核及抑制孢子的產生；楊蕊等[14]研究發現粉紅粘帚霉菌絲可以重寄生苗期玉米莖基腐病病原菌菌絲,導致病菌菌絲細胞原生質顆粒化、潰解，從而達到防治效果。但目前有關粉紅粘帚霉防治棉花黃萎病的報道較少，有待進一步圍繞粉紅粘帚霉防治棉花黃萎病開展系統研究。

本研究還分離出一株在農業和工業都有應用的球毛殼菌。該菌對病原微生物和蚜蟲的生物防治有顯著作用[15-17]，可產生大量有生物活性的次級代謝物[18]，如球毛殼菌素，具有廣譜拮抗性和抗逆性，對多種作物病害具有良好的防治效果。現有研究結果表明，球毛殼菌作為拮抗菌對三七根腐病[19]、油菜根腫病[20]、玉米大斑病[21]以及南方根結線蟲[22]都有很好的防治效果。新疆棉花的產量和品質主要受棉花黃萎病和棉蚜的影響，后續有必要將球毛殼菌作為潛在的棉花黃萎病和棉蚜防治菌，采用以菌治菌、以菌治蟲的防治策略，開發利用球毛殼菌防治棉花病蟲害。

綜上所述，本研究通過對棉花根際土壤真菌的研究，獲得的2株潛在拮抗菌（粉紅粘帚霉和球毛殼菌），可為進一步有效防治棉花黃萎病提供菌種資源[23]，對后續棉花黃萎病在生物防治方面的研究具有重要意義。