日糧中添加不同比例葡萄籽對多浪羊瘤胃真菌菌群結構的影響

彭婉婉 馬忠杰 王 彥 高 帆 許貴善

（塔里木大學動物科學學院/塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

新疆是多民族聚居區，對牛羊肉等畜產品需求量極大。新疆南疆地區由于可利用耕地面積少，種植業結構單一，導致優質粗飼料資源極度匱乏，已成為制約南疆草食畜牧業發展的瓶頸，因此開發利用新型飼料資源顯得更加重要[1-3]。葡萄渣是葡萄釀酒后的副產物，包括葡萄籽、葡萄皮和葡萄梗，是南疆有待開發利用的特色飼料之一[4-5]。研究表明，日糧中添加葡萄渣可提高氮的利用率，但葡萄渣中含有的抗營養因子單寧會影響動物的采食量和營養物質消化率，因此單寧含量是葡萄渣開發利用的制約因素[6-8]。

瘤胃微生物包括細菌、真菌和原蟲，在反芻動物的飼料消化過程中起著重要的作用。與細菌相比，瘤胃中真菌數量較少，但對飼料纖維的降解至關重要[9]。真菌能夠利用其特有的假根系統，優先附著于粗飼料的木質化組織，同時分泌大量纖維素酶、木質素酶和其他水解酶[10]，這些酶可裂解植物木質化組織，從而有利于纖維物質的降解，并促進其他瘤胃微生物對底物的附著和降解[11]。已有研究證實，部分真菌對單寧具有更強的耐受性[12]，部分真菌能夠降解單寧，例如木質素降解菌(Ceriporiopsis subvermispo?ra)和糞生黑蛋巢(Cyathus stercoreus)可使單寧含量分別降低 70% 和 47%[13]，青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、多孔菌屬(Polyporus)和栓菌屬(Trametes)均屬于產單寧酶的真菌,且曲霉屬是目前最具有商業開發價值的產單寧酶菌屬[14]，但反芻動物瘤胃中的真菌屬是否能夠降解單寧還未見報道。高通量測序技術通過測定真菌核糖體DNA的ITS區，進而比較不同真菌間進化發育關系[15-16]，促進了瘤胃真菌菌群結構的研究。本試驗在多浪羊日糧中添加不同比例的葡萄籽，采用高通量測序技術分析多浪羊瘤胃真菌菌群結構的變化，探究添加富含單寧的葡萄籽對多浪羊瘤胃真菌菌群結構的影響，以期為葡萄籽資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗于2019年4月8日—5月8日在塔里木大學動物科學學院試驗站進行。

1.2 試驗日糧

參考美國 NRC(2007)[17]體重 30 kg、日增重 100 g/d的肉羊營養需要，按照“等能等氮”的原則，設計5種添加不同比例葡萄籽的日糧：0%（對照組）、4%（I組）、8%（II組）、12%（III組）、16%（IV組），日糧配方見表1。試驗所用葡萄籽來自伊犁某葡萄酒廠，自然干燥后用中草藥粉碎機粉碎，與各精料原料在混合機內攪拌混勻備用。

1.3 試驗動物及飼養管理

試驗選用15只1.5歲左右，體重41.0±1.0 kg，安裝永久瘤胃瘺管的健康多浪羊羯羊。在晨飼前空腹稱重，根據體重相近原則隨機分為5組，每組3只羊，每組飼喂1種日糧，預飼期15 d，早09：00和晚21：00各飼喂一次，按照維持水平1.2倍飼喂。先喂精料，后喂粗料。試驗羊單籠飼養，自由飲水，試驗開始前一個月每只羊注射1 mL伊維菌素驅蟲。

表1 5種葡萄籽日糧組成及營養成分(干物質基礎)

1.4 樣品的收集

正試期的第10 d在晨飼前（早上8:30）采集瘤胃食糜。每只羊采集10 mL瘤胃食糜，保存于-80℃，送至上海美吉生物醫藥科技有限責任公司進行高通量測序。

1.5 DNA的提取

將樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品，按照試劑盒的操作說明抽提瘤胃液中微生物群落總DNA，以1%瓊脂糖凝膠，5 V/cm的電壓，電泳20 min，判斷提取效果，DNA提取試劑盒為FastDNA SPIN kit for soil(MP Biomedicals,Solon,美國)。

1.6 PCR擴增引物

對真菌ITS1區進行rDNA擴增，擴增引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)及ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGTGC-3′)。擴增試驗采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應體系。

1.7 生物信息學分析

使用Use-arch軟件平臺進行OTUs聚類，將真菌OTUs代表序列與Unite8.0/its_fungi(https://unite.ut.ee/)的真菌數據庫進行比對。使用單因素方差分析法（one?way ANOVA）進行顯著性檢驗，LSD多重比較差異，以P<0.05為差異顯著性判斷標準，結果用平均值表示。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果鑒定膠圖

從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴增真菌DNA的ITS1區，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，取3 μL上樣檢測擴增產物，圖1為真菌PCR擴增結果，如圖可知，真菌的條帶大小在250～500 bp之間。

圖1 真菌PCR擴增結果

2.2 測序基本數據分析

由測序結果可得，真菌樣本序列長度分布在161～340 bp，分布在 321～340 bp的真菌序列數目最高（圖2a），序列大小略低于PCR擴增膠圖結果，是因為擴增引物兩端加入了barcorde，符合建庫要求。由樣本稀釋曲線可看出，隨著隨機抽取測序數據量的增加，真菌樣本稀釋曲線趨于平緩，說明測序數據量足夠。

圖2 真菌樣本長度分布和稀釋曲線

2.3 真菌樣本Alpha多樣性指數

Alpha多樣性用來表示樣本內微生物群落的多樣性，其中ace指數、chao指數代表菌群豐富度，數值越大，表示菌群豐富度越高；而shannon指數和simp?son指數代表菌群多樣性，shannon指數越大，simpson指數越小，說明菌群多樣性越高。由表2可知真菌各指數均在合理范圍，說明數據可科學充分地反映瘤胃真菌菌群的實際情況。真菌Shannon指數IV組最大，顯著性大于對照組、I組和III組（P<0.05），真菌simpson指數IV組顯著低于對照組、I組和III組（P<0.05），說明IV組樣本的菌群多樣性較高。

表2 真菌樣本Alpha多樣性指數

2.4 真菌樣本PCoA分析

圖3為真菌OTUs水平的PCoA分析，即主坐標分析，對微生物群落間的物種多樣性進行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的差異性。圖中使用Bray-curts距離算法，不同顏色點代表不同分組的樣本，兩樣本點越接近，表明兩樣本物種組成越相似。由圖可知，5組樣本點較為聚集，Ⅳ組樣本偏離整體，說明Ⅳ組真菌總體上OTUs水平群落組成較其他組有一定的差異。

圖3 真菌OTUs水平PCoA分析

2.5 真菌樣本OTUs數目

對OTUs進行物種分類學注釋，共注釋1 173種OTUs，分屬于12個門，36個綱，82個目，162個科，287個屬，456個種。由真菌樣本Venn圖（圖4）可以看到，對照組、I、II、III、IV組測得真菌OTUs數量分別為322、258、489、408、718個，各組獨有真菌OTUs數目為IV組>II組>III組>對照組>I組。

圖4 真菌樣本Venn圖

2.6 真菌物種門水平相對豐度

將所有樣本中相對豐度占比小于1%的物種合并，表3中為相對豐度最高的6種菌門。由表可知，多浪羊瘤胃真菌的優勢菌門為新麗鞭毛菌門(Neocallimastigo?mycota)和子囊菌門(Ascomycota)，兩個菌門在瘤胃真菌門中總相對豐度為90.18%～96.13%。II組、IV組新麗鞭毛菌門的相對豐度分別為37.00%、33.36%，較對照組降低了42.59%、48.24%（P>0.05）；II組子囊菌門相對豐度為53.18%，較對照組增加了78.76%（P<0.05）；IV組擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度為11.93%，較對照組增加了241.83%（P>0.05）；II組、III組和IV組被孢霉門(Mortierellomycota)相對豐度為0.94%、1.18%和0.81%，均高于對照組和I組（P>0.05）；與對照組相比，各試驗組均發現了羅茲菌門(Rozellomycota)。

表3 日糧中添加不同比例葡萄籽對多浪羊瘤胃真菌門水平組成的影響（%）

2.7 真菌物種屬水平相對豐度

5組樣本中共檢測到287個菌屬，表4為瘤胃真菌相對豐度較高的15個菌屬。由表可以看出，瘤胃真菌相對豐度較高的10個屬為厭氧鞭菌屬(Anaero?myces)、梨囊鞭菌屬(Piromyces)、未注釋糞殼菌綱(un?classified_c__Sordariomycetes)、枝孢屬(Cladosporium)、未注釋肉坐菌目(unclassified_o__Hypocreales)、Vish?niacozyma、支頂孢菌屬(Acremonium)、未注釋真菌(un?classified_k__Fungi)、階菌屬(Stephanonectria)、曲霉屬(Aspergillus)。I組厭氧鞭菌屬相對豐度最高為67.52%，較對照組增加34.42%（P<0.05），IV組厭氧鞭菌屬相對豐度最小為15.93%，比對照組降低了68.29%（P<0.05）；梨囊鞭菌屬相對豐度隨日糧的變化，先降低然后升高，II組最低（2.82%），較對照組低79.68%；II組未注釋肉坐菌目相對豐度、IV組未注釋子囊菌門相對豐度均顯著高于其余4組（P<0.05）；II組Latorua相對豐度最高，顯著高于對照組、I組和IV組（P<0.05）；II組、III組IV組Vishniacozyma相對豐度較對照組增加了151.63%、97.28%和63.04%（P>0.05）。

表4 日糧中添加不同比例葡萄籽對多浪羊瘤胃真菌屬水平組成的影響（%）

3 討論

本研究中，采用高通量測序技術檢測各處理組的瘤胃微生物區系，稀釋曲線隨著測序數據量的增大趨于平緩(如圖2a所示)，證明測序數據量充分，可進行數據分析。由樣本Alpha多樣性指數可知，5組樣本瘤胃真菌菌群相對豐度、菌群多樣性、菌群覆蓋度均較高，說明本試驗測序量滿足試驗要求，可以反映瘤胃真菌群落的多樣性[19]。Mookiah等[20]體外研究表明，日糧中添加3%的單寧可降低瘤胃真菌菌群的多樣性，其影響程度與單寧的分子量大小有關，日糧中添加1 265.8～652.2 Da的單寧可顯著降低菌群多樣性，但分子量為562.2 Da和469.6 Da時，未對真菌菌群多樣性產生顯著影響。本研究日糧中單寧含量3.45%（Ⅲ組）時，多浪羊瘤胃真菌菌群多樣性與對照組相比無顯著差異，當單寧含量為4.60%（Ⅳ組）時，多浪羊瘤胃真菌菌群多樣性高于對照組，與前人體外研究結果不同，原因是本試驗為體內試驗，瘤胃中微生物種類較體外實驗更為豐富，微生物在瘤胃中擁有較適宜的生長環境，所以不僅未降低瘤胃真菌的多樣性，反而導致微生物多樣性有所提高。

瘤胃真菌生長需要嚴格的厭氧環境，真菌對于日糧中纖維物質具有作用，同時真菌也能降解淀粉、糖原等物質[21]。本研究結果顯示，擔子菌門相對豐度隨著葡萄籽添加量升高而升高，擔子菌門屬于有氧真菌，是棲息在飼料成分中的附生真菌，可能不直接參與瘤胃發酵，因此可根據環境變化而調整適應性[22-23]。吉武龍、張潔等[24-25]研究發現，奶牛瘤胃新麗鞭毛菌門、子囊菌門和擔子菌門的相對豐度分別為16.09%、64.53%和16.23%，本試驗中多浪羊的優勢菌門與上述文獻報道一致。Mookiah等[20]在體外研究中證明，單寧可顯著降低兩種新麗鞭毛科的相對豐度，本試驗日糧中單寧含量2.30%（Ⅱ組）和4.60%（Ⅳ組）時，新麗鞭毛菌門相對豐度顯著降低，但Ⅲ組新麗鞭毛菌門相對豐度相較對照組無顯著性差異，可能是由于動物個體差異導致的，需通過擴大動物樣本進一步深入研究。

厭氧鞭菌屬和梨囊鞭菌屬分類學上屬于新麗鞭毛菌門。研究表明，奶牛瘤胃中厭氧鞭菌屬、梨囊鞭菌屬的相對豐度受日糧結構的影響[26]，Liggenstoffer等[27]分析草食動物消化道內厭氧真菌的組成，發現家養山羊瘤胃厭氧鞭菌屬和梨囊鞭菌屬的相對豐度分別為47.6%和32.8%，張潔、付子琳等[25,28]研究結果顯示，舍飼條件下灘羊瘤胃梨囊鞭菌屬相對豐度為19.93%～38.49%，本研究中，各組多浪羊瘤胃內厭氧鞭菌屬相對豐度為15.93%～67.52%，梨囊鞭菌屬相對豐度為2.82%～13.88%，相對豐度與以上研究略有不同，主要是由日糧和動物品種的差異造成。體外發酵試驗中每克干物質中添加30 mg單寧（469.6～1265.8 Da）可提高瘤胃液中梨囊鞭菌屬4（piromyces4）的相對豐度，但僅分子量為469.6 Da的單寧可增加梨囊鞭菌屬 2（piromyces2）的相對豐度[20]。本研究中，各試驗組梨囊鞭菌屬（piromyces1）相對豐度與對照組無顯著差異，但梨囊鞭菌屬相對豐度隨日糧的變化，先降低然后升高，與日糧中葡萄籽單寧含量有關，具體原因有待進一步研究。Vishniacozyma屬于擔子菌門，在II組、III組和IV組（單寧含量2.30%～4.60%）中相對豐度最高，與葡萄籽的添加量有關，有研究表明，Vishniacozyma是葡萄酒發酵過程中優勢菌，適應性較強，可在-3℃環境下生存[29,30]。谷物降解過程中可產生霉菌，曲酶屬是主要的霉菌，工業上使用曲霉生產各種酶制劑如淀粉酶、蛋白酶和果膠酶等[31]，霉菌對單寧有一定的耐受性，在單寧酸等誘導物存在情況下可發酵產生具有水解催化能力的單寧酶[32]。本研究中，I組（單寧含量1.15%）曲霉屬相對豐度最高，證明瘤胃中通過添加葡萄籽（富含單寧）能誘導曲霉屬生長，隨著日糧中葡萄籽（單寧含量2.30%～4.60%）的增加，曲霉屬相對豐度降低，而針對高粱的研究結果表明，2%～5%的高粱單寧可抑制霉菌的生長，說明曲霉屬豐度變化與單寧含量增加有關。

4 結論

多浪羊瘤胃真菌的優勢菌門為新麗鞭毛菌門(Neocallimastigomycota)和子囊菌門(Ascomycota)。真菌屬相對豐度較高的菌屬的優勢菌為厭氧鞭菌屬(Anaeromyces)、梨囊鞭菌屬(Piromyces)、未注釋糞殼菌綱(unclassified_c__Sordariomycetes)、枝孢屬(Cladospo?rium)、未注釋肉坐菌目(unclassified_o__Hypocreales)、Vishniacozyma、支頂孢菌屬(Acremonium)、未注釋真菌(unclassified_k__Fungi)、階菌屬(Stephanonectria)、曲霉屬(Aspergillus)。日糧中添加葡萄籽可增加瘤胃真菌菌群多樣性，影響部分菌群相對豐度。