燕麥蛋白-結冷膠冷誘導凝膠微觀結構與控釋特性的關聯性研究

楊晨，袁哲，閆可心，胡海玥，汪建明*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.優滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

燕麥中除了含有大量的β-葡聚糖，還含有豐富的蛋白質（12% ～24%）[1-2]，其中球蛋白占總蛋白質含量的70% ～80%，主要由12S、7S和3S蛋白組成[3-4]。前期研究發現，燕麥蛋白（oat protein isolate，OPI）具有良好的凝膠特性[5]。加熱變性后的燕麥蛋白六聚體解聚成活躍的單體，并且二級結構打開，提供了大量的交聯點，在靜電斥力逐漸降低的情況下可促使蛋白質單體有序排列，從而形成類似聚合物凝膠的網絡結構[5-6]。燕麥蛋白這一凝膠結構和加熱變性后的特性使其具有較好的凝膠硬度以及包埋、保護和控釋營養素的能力[6-9]。但是燕麥蛋白凝膠在中性和弱酸性條件下的硬度較弱，在含有胰蛋白酶的模擬胃液中超過1 h，部分燕麥蛋白凝膠會降解，從而影響其在模擬消化液中的控釋能力[7]。在蛋白質中添加多糖可制備不同微結構的凝膠，可有效增強蛋白凝膠的硬度，也可增強其作為載體保護功能性物質活性的能力。

Nieto等研究了在酸性和中性條件下菊粉、卡拉膠和糊精對熱致燕麥蛋白凝膠結構和硬度的影響，發現在加熱凝膠過程中，兩種物質產生了相分離從而使多糖分散在燕麥蛋白凝膠的網絡結構中，同時增加了凝膠內部蛋白質部分的濃度，從而增強了燕麥蛋白-多糖熱致凝膠的硬度[10-11]。然而，加熱條件會破壞熱敏性生物活性物質，熱凝膠作為營養物質遞送體系有一定的局限性，冷誘導燕麥蛋白-多糖混合凝膠的特性還有待研究。

結冷膠（gellan gum，GG）因其凝膠性、透明性高，耐高溫，在較寬的pH值條件下穩定性好，因此廣泛應用于食品體系中以增強食品的質構和穩定性[12-14]。結冷膠與大豆蛋白和蛋清蛋白混合可改善蛋白質凝膠性和結構[15-16]。本研究的預試驗中發現，熱變性后的燕麥蛋白與結冷膠混合形成的凝膠具有較強的凝膠硬度和較好的性質，有望作為營養物質遞送體系。本文通過葡糖酸-δ-內酯（glucono-delta-lactone，GDL）誘導凝膠（冷誘導）的方法，制備熱變性后的燕麥蛋白-結冷膠共混凝膠，通過質構分析、掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、傅里葉紅外光譜等方法，探究不同pH值對共混凝膠的結構、性質以及控釋行為的影響，為燕麥蛋白-結冷膠共混凝膠體系應用在食品工業中提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：加拿大曼尼托巴省；燕麥蛋白（OPI）：加拿大阿爾伯塔大學農業、食品、營養系實驗室提取[10]，蛋白質含量為（90.4±0.6）%；結冷膠（純度為99%，分子量500 kDa）：河南華森食品添加劑有限公司；葡糖酸-δ-內酯（GDL）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

傅里葉紅外光譜儀（NICOLET IS50）：德國Thermo Scientific公司；SU1510掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）：日本 Hitachi公司；激光掃描共焦顯微鏡（confocal）：日本尼康公司；真空冷凍干燥（FD-1-50）：北京博醫康實驗儀器有限公司；紫外可見分光光度計（Evolution300）：Thermo Fisher Scientific公司；恒溫磁力攪拌器（H05-1）：天津東南儀誠科技有限公司；智能數顯磁力加熱控溫攪拌器（TP-350S）：杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥蛋白-結冷膠（OPI-GG）冷誘導凝膠制備

OPI溶于水中并在室溫25℃下攪拌過夜，用1 mol/L NaOH將溶液調節至pH 8。將OPI溶液密封在玻璃瓶中并在115℃（高于變性溫度）油浴中加熱15 min。隨后冷卻至室溫25℃，加入不同濃度的GG（0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%，基于蛋白質干重的質量分數），使得OPI的濃度為7 g/100 mL且保持每個樣品有相同的總體積，并將不同量的GDL（20%，9%，4%，1.5%，基于蛋白質干重的質量分數）加入到溶液中，將溶液儲存在4℃下24 h，形成不同pH值（4、5、6、7）的OPI-GG凝膠。

1.3.2 OPI-GG凝膠質構分析

OPI-GG凝膠制成相同的高度（18 mm）和直徑（22 mm），確保表面和底面的平整，采用P/36R探頭分析凝膠的硬度，測定參數為：測定前速度5 mm/s，測定速度2 mm/s，測后速度5 mm/s，應變位移60%，引發力5 g，引發類型為自動。

1.3.3 復合凝膠微觀結構的觀察

OPI-GG凝膠經液氮速凍后凍干，取自然凍干截面，經表面噴灑鍍金后置于SEM下，觀察不同條件處理后的凝膠微觀形貌[7]。

用激光共聚焦觀察OPI-GG凝膠內燕麥蛋白和結冷膠的分布。將0.54 g的GG和60 mL水混合，然后向混合物中加入10 mg異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），避光攪拌過夜后透析 12 h，冷凍干燥。羅丹明B用于OPI的非共價標記，首先制備蛋白質懸浮液30 mL，然后加入2 mg羅丹明B，混合物在室溫25℃下避光攪拌過夜后透析12 h，冷凍干燥。將標記過的OPI與GG混合，制備凝膠，方法同1.3.1。將制備好的凝膠樣品置于顯微鏡載玻片上，蓋上薄片，并在488 nm和543 nm波長同時獲得熒光圖像[9]。

1.3.4 OPI-GG凝膠分子結構的測定

準確稱量1 mg OPI-GG凝膠的凍干樣品，加入150 mg充分干燥的KBr（其中溴化鉀放在烘箱中105℃烘干超過8h），用研缽將其充分研磨至細末貼壁。使用壓片機（108Pa）將混合粉末壓制1 min成透明薄片，用紅外光譜儀做全波段掃描（4 000 cm-1～400cm-1），分辨率為4 cm-1，掃描次數為16次，以空氣為采集背景，樣品紅外光譜圖經過傅立葉變換后利用OMNIC 8.2軟件進行分析處理。

1.3.5 包埋核黃素的OPI-GG凝膠的控釋行為的測定

OPI（7 g/100 mL）在115℃油浴中加熱變性，冷卻至室溫25℃后加入核黃素（1%，基于蛋白質干重的質量分數）和不同濃度的GG，避光攪拌，制備凝膠（方法同1.3.1）。核黃素的包埋率通過紫外分光光度計測定，先將包埋核黃素的凝膠凍干，粉末溶于蒸餾水，攪拌過夜，6 000 g離心20 min，取上清液，稀釋后，用紫外可見分光光度計445 nm波長下測定吸光度值，根據核黃素的標準曲線計算核黃素包埋量。核黃素包埋率通過以下公式計算：

式中：C0為包埋在凝膠中核黃素含量，mg，C1為核黃素總含量，mg。

將包埋核黃素的OPI-GG凝膠置于pH1.2磷酸緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（37℃）中 2 h后，再將凝膠轉入中性PBS（pH7.4，37℃）8 h進行釋放試驗。每隔特定的時間取樣，采樣之后，補充等體積PBS，以保持恒定的體積。取出的液體離心（6 000 g，10 min）后用紫外可見分光光度計在445 nm波長下測量核黃素吸光值，通過標準曲線，計算其釋放量（R1），在模擬腸液中釋放8 h后，將剩余凝膠破碎，使核黃素充分溶出，離心取上清液稀釋后用紫外分光光度計在445 nm處測量核黃素的吸光值，根據核黃素的標準曲線計算核黃素的量（R2），該值加上核黃素在模擬胃液2 h后釋放的量（R0），即為核黃素的總量（Rt），核黃素的釋放率/%=R1/Rt× 100。

2 結果與分析

2.1 pH值和GG濃度對OPI-GG凝膠硬度的影響

本研究通過質構分析，探究了不同GG濃度和pH值對OPI-GG凝膠硬度的影響，其結果如圖1所示。

圖1 pH值和GG濃度對OPI-GG凝膠硬度的影響Fig.1 Effect of pH and GG concentration on OPI-GG gel hardness

試驗中發現，pH值為7時，OPI-GG凝膠透明且富有彈性，但由于凝膠硬度低于儀器檢測下限，無法被檢測。如圖1所示，不同的pH值對OPI-GG凝膠硬度有顯著影響（P<0.05），凝膠硬度呈現先上升后下降的趨勢。在pH值為6時，OPI與GG的靜電斥力降低，分子間的氫鍵和疏水基相互作用增強，凝膠硬度也隨之增加[8]。當pH值等于OPI等電點（pH值為5）時，OPI與GG因為靜電吸引力形成凝聚體，從而使OPI-GG凝膠硬度增強，此時凝膠硬度最大。當pH值為4時，凝膠硬度降低，由于pH值低于OPI等電點，OPI分子間帶正電荷而產生靜電斥力從而使網絡結構溶脹。在GG濃度為0% ～0.10%時，不同的GG濃度對凝膠硬度也有顯著影響（P<0.05），凝膠硬度隨著GG濃度增加而增加，在GG濃度為0.1%時凝膠硬度達到最大值，隨著GG添加量的繼續增加，凝膠的硬度逐漸降低，其原因可能是過多的GG與OPI分子相互作用，阻礙了OPI分子間和分子內的相互作用從而不能形成堅固的凝膠三維網絡結構[8，17]，最終導致凝膠硬度減弱。凝膠硬度分析結果表明，GG添加量為0.1%、pH值為5時凝膠硬度最大，0.1%GG濃度被選為最優制備OPI-GG凝膠條件。

2.2 不同pH值對OPI-GG凝膠網絡微結構的影響

掃描電子顯微鏡可直觀地觀察不同pH值條件下形成的OPI-GG凝膠的內部結構，如圖2所示。

圖2 不同pH值條件下OPI-GG凝膠掃描電子顯微鏡圖Fig.2 SEM images of OPI-GG gel formed at different pH

從圖2中可以看出，不同pH值條件下形成的OPIGG凝膠均具有類似聚合物的三維網絡結構。OPI-GG在pH 5時的凝膠孔徑最小，形成致密的三維網絡結構。在此條件下，OPI與GG帶相反電荷，分子間具有靜電吸引力，同時OPI分子在預加熱的條件下解聚和伸展，使功能基團暴露出來，有利于蛋白質和多糖之間的相互作用，GG與OPI通過相互作用形成均一穩定的蛋白質-多糖體系，因此，在pH值為5時，OPIGG凝膠具有最強的硬度。在pH值為6時，凝膠網絡結構的孔徑變大，此時OPI所帶負電荷較少[8]，與GG之間雖然存在靜電斥力，但是由于OPI在預加熱變性后功能基團暴露，其與GG之間可能仍因疏水基和氫鍵作用而相互結合，從而形成穩定的結構和較強的凝膠硬度。在pH值為4時，由于pH值遠離OPI等電點，OPI-GG形成凝膠后，其網絡結構隨著pH值降低而吸水溶脹，內部孔徑變大，因此凝膠硬度減弱[8]。同理，隨著pH增加至7，遠離OPI等電點，凝膠結構的孔徑變大，凝膠孔壁變薄，OPI-GG凝膠的硬度變弱。有趣的是，在pH 6和pH 7的條件下，凝膠孔徑雖然變大，但是內部均出現細絲連接的現象。在OPI等電點以上時，OPI-GG存在靜電斥力可能產生相分離，在蛋白質分子和多糖分子凝聚的過程中，OPI和GG可能各自形成網絡，從而形成雙網絡結構，導致凝膠孔內出現細絲網絡結構。

OPI-GG凝膠中蛋白質的多糖在不同pH值條件下的分布情況可通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察，結果如圖3所示。

圖3 不同pH值條件下OPI-GG凝膠中的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.3 Effect of different pH on laser confocal microscopy of OPI-GG gel

由圖3可知，在pH4條件下，加入GDL后，OPI-GG共混物在pH值快速降低的情況下迅速形成凝膠，OPI和GG在凝膠中的分布較均勻。pH 5接近OPI的等電點，OPI帶有少量的正電荷，與GG相互作用力較弱，在pH值快速降低的情況下，OPI-GG形成蛋白質和多糖均勻分布的凝膠，其驗證了SEM的觀察結果，即在pH 4和5條件下，OPI-GG形成了致密的均勻的三維網絡結構。在pH值為6或7時，隨著凝膠網絡的形成，交聯的GG（白色虛線圈內）與OPI分開，嵌入在OPI連續的網絡中，這是由于這個OPI與GG均帶有負電荷，在緩慢凝膠過程中由于靜電斥力而各自形成網絡結構，從而形成相分離狀態的凝膠雙網絡結構。從圖3（pH 7，24 h）中可以看出，GG分布在OPI凝膠的連續網絡結構內，證實了圖2（pH 7）凝膠孔內的細絲是結冷膠在OPI連續的網絡結構中形成的雙網絡結構。

2.3 OPI-GG凝膠分子構象變化

傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）是常用的表征分子中化學鍵或官能團的信息的方法之一[18]。圖4是OPI-GG凝膠在不同pH值下FTIR的吸收光譜圖。

圖4 不同pH值條件下OPI-GG凝膠FTIR圖譜的變化Fig.4 FTIR image of OPI-GG gel formed at different pH value

如圖4所示，隨著pH值降低，在1 640 cm-1處的特征峰吸收硬度增強，OPI與GG之間的作用力逐漸增強。pH 4時，在1 777 cm-1處出現新的峰，代表羧基中C=O伸縮振動，另外，與pH 7條件下形成的凝膠相比，pH 4時形成的凝膠在3 298 cm-1處的特征峰比較尖銳，發生藍移，-OH強吸收[19]，證明分子間氫鍵作用增強，GG上乙酰基與OPI發生乙酰化反應，從而使微結構發生改變。pH 5時，-OH拉伸振動峰在3 303 cm-1變化明顯，這是由于OPI與GG因靜電吸引力而相互作用，OPI中的羥基/氨基與GG的羥基之間形成了較強的氫鍵[20]，證實了在pH 5條件下形成的凝膠因較強的蛋白質與多糖相互作用力而具有較強的凝膠硬度。在pH7時，1411cm-1處-OH的特征峰紅移到1401cm-1，吸收峰也增強，說明OPI-GG凝膠在pH 7時有氫鍵生成。然而，預試驗中發現，在pH 7時，由于OPI和GG均帶有負電荷，它們之間的相互作用力以疏水作用力為主（數據沒有體現）。結合激光共聚焦和掃描電鏡得到的pH 7下OPI-GG形成的雙網絡結構，其氫鍵的形成可能是由于GG自身交聯而成。

2.4 pH值對負載核黃素的OPI-GG凝膠的包埋率和控釋性能的影響

不同pH值的OPI-GG凝膠包埋核黃素的包埋率測試結果如圖5所示。

圖5 不同pH值對OPI-GG凝膠包埋率的影響Fig.5 Effect of different pH on the encapsulation efficiency of OPI-GG gel

由圖5可知，在pH 4和pH 5時，OPI-GG凝膠的包埋率略低，約61%，隨著pH值升高至6和7，包埋率分別增加至67%和75%。在pH 6和pH 7條件下，OPI-GG凝膠由于靜電斥力產生相分離，形成雙網絡結構，因此可有效阻止核黃素的溶出，提高凝膠的包埋率。

包埋核黃素的OPI-GG凝膠在PBS中的釋放試驗如圖6所示。

圖6 包埋核黃素的OPI-GG凝膠在PBS（pH 1.2，pH 7.4）中的釋放曲線圖Fig.6 Release rate of riboflavin encapsulated in OPI-GG gels in PBS（pH 1.2，pH 7.4）

由圖6可知，pH 7條件下不添加GG制備的OPI凝膠，在pH 1.2的酸性PBS中2 h時，核黃素的釋放率為42%，加入0.1%的GG以后，在pH 1.2的PBS環境下2 h時釋放率為33%，隨著凝膠制備的pH值降低至5和4時，2 h的核黃素釋放率降低至18%和16%。在pH 7.4的PBS中，不加GG的OPI凝膠3 h以后幾乎釋放全部核黃素。加入0.1%的GG后，在pH 7和pH 6條件下制備的凝膠核黃素的釋放率明顯，低于不加GG的凝膠。當凝膠pH值為4和5時，在pH7.4 PBS中浸泡8 h后，核黃素的釋放率降低至49%和53%。

OPI-GG凝膠釋放核黃素的機制與其結構和相互作用力有很大關系。在pH 4和pH 5時，SEM和FTIR的結果顯示，相對于pH 6和pH 7形成的雙網絡結構凝膠，其凝膠壁的孔徑較小，網絡比較致密，而且凝膠的形成速度較快，OPI和GG形成更強的相互作用力，所以在pH 4和pH 5條件下形成的OPI-GG凝膠在pH 1.2的條件下受酸性環境的影響較小，可以控制核黃素的釋放率在17%左右，在pH 7.4的條件下通過擴散緩慢釋放核黃素。試驗結果證明，具有雙網絡結構的OPI-GG凝膠具有較好的包埋能力，具有均勻致密的單網絡結構的OPI-GG凝膠具有較好的控釋能力，因此，OPI-GG凝膠具有作為營養素包埋和遞送體系應用在食品工業中的潛力。

3 結論

本文通過GDL冷誘導制備OPI-GG凝膠，利用質構分析、掃描電鏡、激光共聚焦、FTIR等方法研究不同制備條件下混合凝膠的硬度，以及不同pH值條件下凝膠微結構與控釋特性之間的關聯性。結果表明在GG添加量為0.1%pH 5條件下制備的凝膠硬度最大。凝膠硬度與凝膠結構和分子構象的變化有關，pH 4和pH 5時，由于靜電引力的相互作用，OPI與GG之間相互作用力增強，OPI-GG凝膠形成致密的均勻的單網絡結構。在pH 6和pH 7時，OPI與GG由于靜電斥力的作用產生相分離，從而形成雙網絡結構。具有不同微結構的OPI-GG凝膠可作為基質包埋核黃素，研究結果表明，OPI-GG雙網絡結構凝膠的包埋率為75%，其在pH 1.2 PBS中2 h時釋放核黃素33%；OPI-GG致密單網絡結構凝膠的包埋率為61%，在pH 1.2 PBS中2 h時釋放核黃素18%。本研究結果證明，在pH 6和pH 7條件下制備的OPI-GG雙網絡結構冷凝膠具有較好的核黃素包埋能力，在pH 4和pH 5條件下制備的具有均一致密結構的OPI-GG單網絡冷凝膠具有較好的控釋能力，具有不同微結構的OPI-GG冷凝膠可作為營養素包埋和遞送體系，為其應用在食品中作為營養素載體提供理論基礎。