椴樹蜜純度鑒定及其抗氧化活性研究

張孟歷，張宏武，賈紅梅，于猛，王寶龍，鄒忠梅*

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；3.中國質量萬里行促進會生態蜂業專業委員會，北京 100031）

蜂蜜是由蜜蜂科昆蟲意大利蜜蜂（Apis mellifera Ligustica.）及中華蜜蜂（Apis cerana cerana Fabricius）吸收植物花粉，與自身分泌物結合后，在蜂巢中存放釀造而形成的天然甜物質[1-2]，是公認的具有多種生物活性的天然食品。蜂蜜作為藥用歷史悠久，始載于《神農本草經》，稱蜂蜜為藥中之上品，其中記載“蜂蜜味甘、平，無毒，主心腹邪氣，諸驚癇痙，安五臟諸不足，益氣補中，止痛解毒，除百病和百藥。久服強志輕身，不饑不老，延年”[3-5]。

蜂蜜的品種常常由養蜂人根據蜂巢位置及其附近可用的花源進行主觀判定，但對蜂蜜品種純度關注不多[6-9]。蜂蜜的純度直接影響蜂蜜的外觀、口感及生物活性。應用現代分析技術如高效液相、核磁共振等可建立鑒別蜜源植物的方法，但花粉種類作為蜜源植物的判斷依據[10-12]仍然是最直觀的指標。蜜蜂采集花蜜的同時，也會采集到蜜源植物的花粉，而每一種植物花粉都有自己特有的形態特征，因此根據蜂蜜中的花粉種類和數量可以鑒定蜂蜜的種類和質量。通常認為“某種花的花粉率大于50%定義為該蜜源植物的單花蜜，小于50%則為雜花蜜或百花蜜”[13]。

椴樹蜜是蜜蜂采集椴樹屬植物椴樹[紫椴（Tilia amurensis Rupr.）、糠椴（Tilia mandshurica Rupr.et Maxim）等]花蜜釀造而成的蜜，主產于完達山脈、大興安嶺、小興安嶺、長白山脈及俄羅斯遠東地區，作為我國東北地區的特色蜜種，產量大且營養價值高。純正椴樹蜜色白偏黃，口感細膩，具有治療便秘、失眠、高血壓、支氣管炎等多種疾病的作用，也是肝臟疾病和神經衰弱癥的良好輔助劑[14]。目前，對椴樹蜜的研究不多，主要集中在成分與活性相關報道，有報道顯示，椴樹蜜中含有黃酮等酚類成分，并顯示其有一定抗氧化活性[15-17]。但酚性成分含量、抗氧化活性是否與椴樹蜜純度具有相關性尚未見研究報道。因此，本文首先測定了來自東北地區且蜂農認定的椴樹蜜中椴樹花粉含量，鑒定椴樹蜜的純度，區分椴樹單花蜜與椴樹雜花蜜；通過福林酚法測定了椴樹單花蜜與椴樹雜花蜜總酚含量；并測定了椴樹單花蜜與椴樹雜花蜜的抗氧化活性，為椴樹蜜質量評價及生物活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椴樹蜜，2018年從我國東北地區8位蜂農處收集，共16批，詳細資料見表1。

表1 椴樹蜜樣品來源信息表Table 1 Source information of linden honey

1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、總抗氧化能力檢測試劑盒（2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基清除法，ABTS法）：Sigma公司；蒸餾水：屈臣氏；色譜甲醇（批號L-14834）：美國Fisher公司；甘油明膠（規格 10 mL，批號 20180925）：Solarbio公司；沒食子酸（批號030002710001，純度≥98%）：南京澤朗生物科技有限公司；無水碳酸鈉（批號20180118）：北京市通廣精細化工公司；福林酚試劑（批號SL28211620）：Coolaber公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（鐵離子還原能力法，FRAP法）：碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

MSA125P-100-DU電子分析天平：德國SARTORIUS公司；KQ-500E超聲振蕩儀：昆山市超聲儀器有限公司；Axio Observer D1顯微鏡：德國ZEISS公司；SUNRISE型酶標光度計：美國Tecan公司；UV-3100紫外-可見分光光度計：上海MAPADA公司。

1.3 方法

1.3.1 椴樹蜜花粉含量的測定

椴樹蜜花粉含量的測定參考張金振等[18]文獻里的方法稍作改變。提取方法：將蜂蜜樣品混勻后稱取2 g椴樹蜜，加水4 mL，混勻。2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，再加4 mL水，2 000 r/min離心10 min。小心傾出上清液后，沉淀加200 μL水混勻備用，待制片用。制片：在40℃的水浴中液化甘油明膠，同時將載玻片和蓋玻片放置于40℃加熱板上預熱，分別吸取100 μL懸濁液于兩塊預熱的載玻片上，將載玻片于40℃加熱板上加熱，直到載玻片的沉淀物完全干燥；于預熱的蓋玻片上滴一滴甘油明膠，使其在蓋玻片對角形成一個大的十字，將蓋玻片緩慢地蓋在沉淀物上，以防止形成氣泡。蓋好蓋玻片后稍稍加熱，以保證甘油明膠均勻地分布并使花粉充分膨脹，在甘油明膠冷卻凝固后進行顯微鏡觀察分析。

1.3.2 椴樹蜜總酚含量的測定

采用福林酚法測定椴樹蜜中的總酚含量[19-20]。準確吸取沒食子酸標準品貯備液（1.0 g/L）0、80、160、240、320、400、480、560 μL 分別置于 2 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混勻后待測。取各濃度沒食子酸上清液0.5 mL與2.5 mL 0.2 mol/L福林酚溶液混合，5 min后加入100 g/L的碳酸鈉溶液2 mL，加水定容至10 mL，反應2 h后（避光），以蒸餾水為空白對照，在760 nm下測定吸光度值。以沒食子酸的量（μg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。取樣品上清液0.5 mL與2.5 mL的0.2 mol/L福林酚溶液混合，5 min后加入100 g/L的碳酸鈉溶液2 mL，用10 mL容量瓶定容，反應2 h后（避光），在760 nm條件下測定吸光度值。

1.3.3 椴樹蜜DPPH自由基清除能力的測定

分別取 100 μL 的 10、25、40、55、70 g/L 的蜂蜜樣品水溶液各加100 μL的0.05 g/L DPPH甲醇溶液（避光，現用現配）于96孔板中，室溫（25℃）避光反應30 min，在517nm下測定吸光度記為A2；100μLDPPH甲醇溶液+100 μL蒸餾水與 100 μL甲醇溶液 +100 μL蜂蜜樣品水溶液在上述條件下測得的吸光度值分別記為A1、A3。計算各樣品對DPPH自由基的清除率。根據椴樹蜜溶液濃度及清除率，通過GraphPad Prism 5軟件，計算出IC50值。

1.3.4 椴樹蜜ABTS+自由基清除能力的測定（ABTS法）

按照試劑盒內說明書提供的方法測定椴樹蜜總抗氧化能力。按說明書方法配制各工作液，在96孔板中每孔依次加入：10μL各濃度Trolox標準液（0、0.015、0.045、0.105、0.21、0.42 mmol/L）或樣品溶液 +20 μL 肌紅蛋白工作液+150 μL ABTS工作液，5 min后各孔加入100 μL反應停止液，于405 nm測定吸光度。

1.3.5 椴樹蜜鐵離子還原能力的測定[（ferric reducing antioxidant power，FRAP）]

按照試劑盒內說明書提供的方法測定椴樹蜜總抗氧化能力。按說明書方法配制各工作液，在96孔板中每孔加入：180 μL FRAP工作液+5 μL蒸餾水或各濃度 FeSO4標準液（0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L）或樣品溶液。37℃孵育5min后于593nm測定吸光度。

1.3.6 數據處理

有數據經excle和Graphpad Prism 5軟件進行數據統計和圖表制作，試驗結果以均數±標準差（±s）表示。

2 結果與分析

2.1 椴樹蜜純度測定

顯微鏡下觀察花粉形態，椴樹花粉特征明顯，見圖1。

圖1 椴樹花粉顯微鏡下形態（×400）Fig.1 The morphology for linden pollen under the microscope（×400）

從圖1中可以看出椴樹花粉外觀呈圓形至橢圓狀態，圓內可見一類三角形圖案，特征明顯，與文獻[18]報道一致。而其余花粉或呈圓形，內部布滿小點，或外觀呈三角形，與椴樹蜜花粉區別明顯。通過對16批椴樹蜜分別進行觀測，結果見表2。

由表2可知，發現所有樣品中均能觀察到椴樹花粉的存在，說明均為椴樹蜜。但所含椴樹花粉占總花粉的量不同，從7.14%～76.73%不等，表明其所含椴樹蜜的純度差異較大。依據文獻[13]，其中7批次的椴樹蜜中椴樹花粉率大于50%，可判定為椴樹單花蜜，其他批次椴樹花粉率小于50%，判定為椴樹雜花蜜。

2.2 椴樹蜜總酚含量

根據試驗結果以沒食子酸量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制的標準曲線方程為y=0.011x+0.023 9（R2=0.999）（圖 2）。

表2 各批次椴樹蜜花粉含量測定結果（n=3）Table 2 Determination of pollen content of each batch of Linden honey（n=3）

圖2 沒食子酸標準曲線圖Fig.2 The standard curve for gallic acid

椴樹蜜總酚含量以相對沒食子酸的量表示，詳細結果見表3。表3結果顯示椴樹蜜總酚含量以沒食子酸計在 174.64 μg/g ～329.18 μg/g，總酚含量最高的為 2 號椴樹蜜，為329.18 μg/g，其次為8號椴樹蜜，總酚含量最低為4號椴樹蜜，為174.64μg/g，其中椴樹單花蜜總酚含量為 174.64 μg/g ～222.82 μg/g，椴樹雜花蜜總酚含量為 223.73 μg/g ～392.18 μg/g。椴樹雜花蜜總酚含量稍低于單花蜜，但不具有顯著差異。

2.3 椴樹蜜對DPPH自由基的清除作用

16批椴樹蜜對DPPH自由基均有不同程度的清除作用，且清除率隨樣品濃度的增加而增強。由表3可知，各批次椴樹蜜DPPH自由基清除率IC50值在（24.72±6.89）g/L ～（107.76±34.17）g/L 之間，其中椴樹單花蜜 IC50值為（46.61±10.91）g/L ～（107.76±34.17）g/L，椴樹雜花蜜 IC50值為（24.72±6.89）g/L ～（76.75±8.09）g/L，沒有顯著區別。與文獻[17]報道的椴樹蜜DPPH清除率IC50值35.35 mg/mL～87.93 mg/mL基本吻合。

表3 各批次椴樹蜜抗氧化能力及總酚含量測定結果Table 3 Determination of antioxidant capacity and total phenolic content of all selected samples of Linden honey

2.4 椴樹蜜對ABTS+自由基的清除能力

標準曲線圖見圖3。

圖3 標準曲線圖Fig.3 The standard curve

以Trolox濃度（mmol/L）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制的標準曲線方程為y=-1.479 7x+1.044 9（R2=0.992 9）（圖 3A）。以 Trolox計，16批椴樹蜜 ABTS+自由基的清除能力為 （0.14±0.07）mmol/kg ～（0.56±0.04）mmol/kg，其中椴樹單花蜜ABTS+自由基的清除能力為（0.14±0.07）mmol/kg ～（0.43±0.10）mmol/kg，椴樹雜花蜜ABTS+自由基的清除能力為（0.25±0.01）mmol/kg ～（0.56±0.04）mmol/kg，詳細結果見表 3。

2.5 椴樹蜜的鐵離子還原能力

以FeSO4濃度（mmol/L）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制的標準曲線方程為y=0.311 9x+0.048 4（R2=0.9999）（圖3B）。以FeSO4計16批椴樹蜜鐵離子還原能力為（1.96±0.08）mmol/kg ～（3.81±0.11）mmol/kg，其中椴樹單花蜜鐵離子還原能力為（1.96±0.08）mmol/kg ～（2.82±0.08）mmol/kg，椴樹雜花蜜鐵離子還原能力為（2.08±0.07）mmol/kg ～（3.81±0.11）mmol/kg，詳細結果見表3。

3 結論

收集的16批樣品為蜂農認定的椴樹蜜，均檢測到椴樹花粉，但花粉測定結果顯示椴樹花粉含量差異較大，從7.14%到76.73%不等，因此，可根據椴樹花粉含量判斷椴樹蜜的純度，以區分椴樹單花蜜與雜花蜜。結果表明，其中7批椴樹蜜中椴樹花粉含量大于50%，定義為椴樹單花蜜；9批椴樹花粉含量小于50%，定義為椴樹雜花蜜。本文還對各批次椴樹蜜的總酚含量進行了測定，總酚含量以沒食子酸計在174.64 μg/g ～329.18 μg/g，與文獻報道結果基本一致，其中椴樹單花蜜總酚含量為 174.64 μg/g ～222.82 μg/g，椴樹雜花蜜總酚含量為223.73 μg/g ～329.18 μg/g，二者差異不大。大量研究表明總酚含量與抗氧化活性存在一定的關系[21-22]，一般來說總酚含量越高，其抗氧化活性越好。采用DPPH法、ABTS法及FRAP法3種方法對椴樹蜜的抗氧化能力進行了評價，結果顯示，所有批次椴樹蜜均具有一定抗氧化作用，抗氧化活性與其總酚含量呈正相關，但單花蜜與雜花蜜的抗氧化能力差異不大，表明椴樹蜜抗氧化活性與椴樹蜜純度相關性不強。