冷凍處理對大豆分離蛋白結構和乳化性質的影響

胡海玥，閆可心，趙婭柔，何琳琳，汪建明*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津市利民調料有限公司，天津 300000）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一種全價粉狀食品原料和食品添加劑，是將低溫脫溶豆粕作為原材料[1]，經過一系列加工生產出來的。其蛋白質含量超過90%[2]，并包含人體必需的20種氨基酸[3]，具有較高的營養價值。大豆分離蛋白因其原料成本低、來源較為廣泛[4]，在食品工業生產中應用較多[5-6]。大豆分離蛋白是一種表面活性劑，可以降低水和油的表面張力，形成穩定的乳狀液，所以常被作為乳化劑應用在冷凍食品中。冷凍是食品工業生產和日常生活中食物保藏最主要的手段[7]，然而在實際生活和工業生產過程中，大豆分離蛋白在冷凍處理后會發生一定的變性[8]，影響含有或添加大豆分離蛋白食物的口感和質量。這些因素嚴重阻礙了工業上對冷凍食品的開發和銷售。

蛋白質在外力作用下較容易聚集[9]。當外部環境發生變化時（如熱處理，離子強度變化或冷凍）[10]，蛋白質內部的活性基團可能會暴露出來，引起共價和非共價聚集。然而，目前對大豆分離蛋白的研究多數集中在糖基化、熱處理、超聲和高壓等方面[11-15]。Ahmed Taha等[10]研究不同超聲乳化條件對含中鏈甘油三酸酯（medium chain triglycerides，MCT）的大豆分離蛋白乳液的理化性質的影響，發現高強度超聲（high intensity ultrasound，HIU）可以輔助生產出穩定的大豆分離蛋白乳化液。左穎昕等[12]研究葡萄糖接枝對大豆分離蛋白功能特性和結構的影響，研究發現糖基化改性大豆分離蛋白質后，其二級結構和空間結構發生了變化，并且發生了美拉德反應。本文從大豆分離蛋白的微觀結構的變化入手，應用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、內源熒光光譜以及傅立葉紅外光譜等方法，探究冷凍條件對大豆分離蛋白和乳狀液的粒徑分布、微觀結構和穩定性的影響，并對照樣品進行比較，以期為工業上優化冷凍植物蛋白方法提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白（蛋白含量90%以上）：河北塞億生物科技有限公司；羅丹明B（分析純）、考馬斯亮藍（R250，指示劑）：北京Solarbio科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純）：北京鼎國生物技術有限公司；過硫酸鉛（分析純）：上海研域生物科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（分析純）：生工生物工程有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

海爾電冰箱（BCD-175F）：青島海爾股份有限公司；熒光分光光度計（RF-5301pc）：日本津島公司；紫外-可見分光光度計（SP-752）、電泳儀（DYY-12）：上海舜宇恒平科技儀器有限公司；紫外可見分光光度計（Evolution300）：Thermo Fisher Scientific公司；傅里葉紅外光譜儀（NICOLET IS50）：德國Thermo Scientific公司；Tuibiscan ASG靜態多散射穩定性分析儀：北京朗迪森科技有限公司；倒置熒光顯微鏡（CKX41）：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍大豆分離蛋白的制備

將大豆分離蛋白與水按比例混合，使其蛋白濃度為0.04 g/mL，在室溫（25℃）下利用磁力攪拌使其充分混合均勻，靜置20 min。移入容器（長×寬為40 cm×20 cm）中，在-5℃和-20℃下冷凍。將冷凍后的大豆分離蛋白在室溫（25℃）下使用相同流速的水流解凍。將解凍后的大豆分離蛋白放入鼓風干燥箱中在40℃下烘干8 h，烘干后的樣品進行粉碎，過篩（80目），放入干燥器中儲存備用。

1.3.2 大豆分離蛋白分子量的測定

利用SDS-PAGE電泳對大豆分離蛋白的分子量進行測定[16]，得到冷凍處理后的大豆分離蛋白SDSPAGE電泳圖。

1.3.3 大豆分離蛋白三級結構測定

使用熒光分光光度計測定大豆分離蛋白的三級結構。將待測樣品溶于0.01 mol/L、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中，配制成1 mg/mL的溶液。在激發波長為290 nm、靈敏度為2 nm、狹縫為5 nm的條件下，以蛋白質內部熒光基團作為熒光光譜探針，空白對照為磷酸鹽緩沖液，測定發射波長在300nm ～400nm的熒光光譜，得到冷凍誘導大豆分離蛋白聚集體的熒光光譜圖。

1.3.4 大豆分離蛋白二級結構的測定

準確稱量1 mg大豆分離蛋白樣品和充分干燥的溴化鉀150 mg（105℃，8 h），充分混合后研磨至粉末，并壓制成透明薄片，使用紅外光譜儀進行全波段掃描（4 000 cm-1～400 cm-1），以空氣為背景，設定4 cm-1分辨率，掃描16次，并通過傅立葉變換得到樣品紅外光譜圖。

1.3.5 大豆分離蛋白乳狀液的制備

將大豆分離蛋白樣品溶于去離子水中，配制0.002 g/mL大豆分離蛋白去離子水溶液，磁力攪拌2 h（25℃）后以油水比1∶3（體積比）緩慢加入大豆色拉油得到混合液，加入0.25%（基于混合液體積）的0.02%疊氮化鈉，混合均勻后放入高速剪切均質機中，在12 000 r/min條件下處理3 min，制得均勻的大豆分離蛋白乳狀液[17]。

1.3.6 大豆分離蛋白乳狀液液滴分布測定

參考Feng等的方法[18]，測定大豆分離蛋白乳狀液粒徑。

1.3.7 大豆分離蛋白乳狀液微觀形態觀察

采用倒置熒光顯微鏡觀察大豆分離蛋白乳狀液的微觀形態[19]。將制備好的樣品乳狀液取0.5 mL滴在載玻片上，用羅丹明B染色，小心蓋上蓋玻片，迅速放入倒置熒光顯微鏡下，對乳狀液微觀形態進行觀察和拍照。

1.3.8 大豆分離蛋白乳狀液穩定性動力學指數測定（turbiscan stability index，TSI）

量取大豆分離蛋白乳狀液25 mL，放入Turbiscan測試瓶中。冷凍大豆分離蛋白分散液的穩定性動力學指數應用靜態多散射穩定性分析儀進行測定[19]。取0.1 g樣品放入30 mL 0.01mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，磁力攪拌2 h（25℃）后放入Turbiscan測試瓶中。在溫度26℃，30 min掃描1次，測定6 h。以未冷凍處理的大豆分離蛋白作為對照組。

1.3.9 統計分析

所有試驗均重復測定3次，試驗數據通過Excel 2007和Orign 8.0進行統計分析。使用Adobe Photoshop CS6對圖片進行處理。

2 結果與分析

2.1 冷凍處理對大豆分離蛋白分子量的影響

為探究經過冷凍處理后的大豆分離蛋白分子量的變化，對冷凍處理后的大豆分離蛋白作SDS-PAGE凝膠電泳分析結果見圖1。

圖1 0.04 g/mL大豆分離蛋白冷凍處理后的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis pattern of 0.04 g/mL SPI after freezing treatment

7S和11S是大豆分離蛋白的兩種重要組成成分。11S是通過二硫鍵將一個酸性（A亞基）和一個堿性（B亞基）多肽鏈連接而形成。7S主要是通過疏水相互作用，將α′、α、和β亞基相互連接而成。如圖1所示，將通道2、3、5、6與通道1進行對比，發現其樣品中的亞基組成與對照組相似，主要亞基均為7S和11S，變化并不顯著。這說明大豆分離蛋白經-5℃和-20℃冷凍處理后，產生的變性多數為可逆變性[20]，但通道4的條帶較為分散，說明長時間的冷凍處理會使大豆分離蛋白產生不可逆變性。且所有冷凍后的樣品與未經冷凍相比，條帶都有所變淺，證明冷凍使大豆分離蛋白都產生了聚集行為，形成了不溶性的聚集體，從而導致分子量的變化。

2.2 冷凍處理對大豆分離蛋白三級結構的影響

內源熒光性質可以顯示因蛋白質聚集導致的蛋白分子內部各基團距離減少的變化，而引起蛋白質內源熒光發射光譜的主要氨基酸殘基為色氨酸。因此，通過內源熒光發射光譜能夠反映色氨酸微環境的極性變化過程，且通過內源熒光光譜中最大峰的熒光強度和位置的變化，可以較為準確地判斷蛋白質在三級結構水平上的構象變化情況[21]。圖2顯示了冷凍處理對大豆分離蛋白聚集體熒光強度的影響。

圖2 冷凍處理大豆分離蛋白聚集體的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectrum of aggregates of frozen induced SPI

色氨酸殘基所在的微環境決定了其最大的吸收波長，若大部分的色氨酸殘基被蛋白分子內部的非極性環境所包圍，則其最大吸收波長小于330 nm；若色氨酸殘基處于蛋白分子外部的極性環境中，表明色氨酸殘基不再被蛋白分子的非極性環境所包圍或包圍強度變得更加松散，則其最大吸收波長將大于330 nm[22]。由圖2可以看出，所有樣品的最大吸收波長均大于330 nm。而在-5℃下處理的樣品最大吸收峰的峰壁高于-20℃條件下的峰，最大吸收峰紅移程度更大，且最大吸收峰的峰強更高，這種現象表明色氨酸殘基的微環境極性增加了，即熒光基團更多地暴露在溶液中，蛋白質聚集會導致蛋白分子內部的基團之間的距離降低，從而引起內源熒光強度的變化。以上結果表明，冷凍導致蛋白質聚集，從而改變了大豆分離蛋白的三級構象。

2.3 冷凍處理對大豆分離蛋白二級結構的影響

蛋白質的二級結構由不同類型的氫鍵所構成。這些氫鍵在主肽鏈中組成具有規則性的周期空間構象，構成了二級結構的基本單元。傅立葉紅外光譜中的酰胺I帶可以表征蛋白質的二級結構。冷凍誘導大豆分離蛋白的傅立葉紅外吸收光譜圖見圖3。

圖3 冷凍誘導大豆分離蛋白的傅立葉紅外吸收光譜圖Fig.3 FT-IR spectroscopy of SPI induced by frozen

從圖3不同樣品的吸收峰的峰形和吸光度變化可以判斷出，冷凍處理引起了大豆分離蛋白二級結構的變化。為了探究蛋白質二級結構單元的變化程度，對酰胺I譜帶的吸收峰（1 600 cm-1至1 700 cm-1）進行了基線校正。對每個樣品光譜進行分析，結果如表1所示。

由表1可知，蛋白質的二級結構主要由主鏈上的羰基和酰胺基之間的氫鍵所維持，主要由：α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲所組成。當蛋白質所在環境變化，蛋白質分子會進行構象重排以達到穩定狀態。未經處理的大豆分離蛋白的β-類型結構82.92%，其中β-折疊和β-轉角的含量分別為32.71%和50.21%，而α-螺旋和無規卷曲相對較少，分別為9.90%和7.18%。經冷凍處理后，樣品的β-類型結構均少于80%，β-折疊的含量增加，β-轉角的含量降低，表明冷凍可能會導致蛋白質聚集。而α-螺旋和無規卷曲含量的增加表明蛋白質聚集為無序結構。結果表明，冷凍處理后蛋白質變性，導致不同程度的蛋白質聚集，從而對二級結構產生影響。

表1 冷凍對大豆分離蛋白二級結構單元含量計算結果的影響Table 1 Effect of freezing on secondary structure element content of SPI

2.4 冷凍處理對大豆分離蛋白乳狀液的液滴分布的影響

經冷凍處理后的大豆分離蛋白容易產生聚集，從而影響大豆分離蛋白的乳化特性。利用粒徑分布可以判斷冷凍對大豆分離蛋白乳狀液的影響。乳狀液的粒徑分布如圖4所示。

圖4 冷凍處理對大豆分離蛋白乳狀液粒徑分布的影響Fig.4 Effect of freezing on particle size distribution of SPI emulsion

從圖4中可以看到，經冷凍處理后的大豆分離蛋白所形成的乳狀液的液滴粒徑分布變化較大。未經處理大豆分離蛋白乳狀液中粒徑分布最集中且粒徑最小，大多數在20 μm以下。冷凍處理后的大豆分離蛋白形成的乳狀液粒徑分布與對照組相比較為靠右，峰型變寬，多數粒徑分布在10 μm ～50 μm之間，經-5℃冷凍后的大豆分離蛋白所形成的乳狀液粒徑峰值接近19 μm，而-20℃的粒徑峰值為30 μm。表明經冷凍處理，乳狀液粒徑變大，分布變得較為分散。說明乳狀液中存在冷凍誘導形成的蛋白聚集體[23]，且聚集體并未因為均質剪切而被破壞。

2.5 冷凍處理對大豆分離蛋白乳狀液的微觀形態影響

通過對蛋白乳狀液的界面性質進行研究，可以了解蛋白的乳化性質和乳化能力。冷凍大豆分離蛋白乳狀液的微觀形態圖片經過Adobe Photoshop CS6軟件的黑白處理，如圖5所示。

圖5 大豆分離蛋白乳狀液的微觀形態圖Fig.5 Microscopic morphology of frozen SPI emulsion

由圖5可以看出，在大豆分離蛋白的乳狀液中，形成的是水包油型的乳狀液。在未經冷凍處理的大豆分離蛋白形成的乳狀液中，油滴分布小而均勻，表明乳化效果好。未經冷凍處理的大豆分離蛋白形成的乳狀液與經過冷凍的相比具有更強的乳化能力。經-5℃和-20℃處理的大豆分離蛋白乳狀液的熒光分布因為乳狀液中有蛋白聚集體的存在而不均勻，這與傅里葉紅外光譜和粒徑分布結果一致。

2.6 冷凍處理對大豆分離蛋白乳狀液穩定性的影響

通過對冷凍大豆分離蛋白乳狀液進行的微觀形態分析，發現對冷凍大豆分離蛋白進行乳化，并不能破壞其存在的聚集體結構，因此對大豆分離蛋白乳狀液進行穩定性研究見圖6。

圖6 冷凍溫度對大豆分離蛋白乳狀液穩定性動力學指數的影響Fig.6 Effect of freezing temperature on the stability kinetics index of SPI emulsion

穩定性動力學指數值越小，說明乳狀液越穩定。由圖6可以看出，未經冷凍的大豆分離蛋白形成的乳狀液最為穩定，經過冷凍處理后的蛋白形成的乳狀液的穩定性都發生了不同程度的降低。查閱文獻[24-25]后發現，可能是蛋白質形成了一些低粒徑的可溶性聚集體，從而引發乳狀液的沉降；因此，與未經處理的大豆分離蛋白乳狀液比較，冷凍處理后的大豆分離蛋白乳狀液的穩定性較差。

3 結論

本文通過對冷凍大豆分離蛋白進行研究，利用SDS-PAGE凝膠電泳、內源熒光光譜、傅立葉紅外光譜的測定，研究冷凍處理對蛋白的分子量、蛋白三級結構和二級結構的影響變化，結果表明冷凍使大豆分離蛋白產生的可逆變性；大豆分離蛋白三級構象發生變化；冷凍后的大豆分離蛋白的結構向無序化發展。為了解冷凍對大豆分離蛋白的乳化特性的影響，對其乳狀液的粒徑分布、微觀結構和穩定性進行研究。研究表明，冷凍使蛋白乳狀液的粒徑變大，更加分散了液滴粒徑；降低了大豆分離蛋白的乳化能力；降低了乳狀液的穩定性。本研究所得結果可以為今后進一步提高工業冷凍植物蛋白的質量提供一定的理論支撐。