美極梅奇酵母與釀酒酵母混合發酵對火龍果酒品質特性的影響

劉曉柱，趙湖冰，黎華，李銀鳳，于志海，劉曉輝，HARDIE William James，2，黃名正*

（1.貴州理工學院，貴州 貴陽 550003；2.常州大學，江蘇 常州 213000）

釀造酒由原料經發酵后獲得的酒精飲料，原料轉化為乙醇主要由酵母菌進行生物轉化。根據酵母菌發酵特性將其分成釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和非釀酒酵母（Non-Saccharomyces cerevisiae，NSc）兩大類[1]。Sc主要進行酒精發酵，將原料中的糖轉化為乙醇、二氧化碳和其它副產物[2]。利用Sc進行純種發酵，操作簡單、易于控制，但發酵酒中風味物質種類及含量均有限，酒質風味較為單一。近年來利用NSc與Sc進行混合發酵改善果酒的風味，已成為研究的一個熱點。NSc可產生多種酯類、醇類、甘油以及多種酸類等風味物質，在很大程度上影響果酒的色澤、風味以及復雜度，對果酒的感官品評具有重要的影響[3-5]。

美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，Mp）是一種常見的NSc，天然存在于各種水果、蜜腺、花朵等植物結構上[6]。在葡萄汁的酒精發酵前期，通常情況下可以檢測到Mp的存在。Clemente-Jimenez等研究發現，在Mp與Sc共培養時，二者具有協同作用，有助于包括脂肪酸、酯和萜烯醇等多種芳香化合物的產生[7]。研究還發現，某些Mp菌株能夠表達高水平的β-葡萄糖苷酶，并作用于多種含糖苷鍵的風味前體物質，有助于如萜烯類風味物質的釋放，增強酒體風味特性[8]。此外，Mp與Sc混合發酵還能夠降低發酵酒中的乙醇含量，同時增加酒體復雜度，可用于低度酒的發酵生產[9]。但Mp與Sc混合發酵對火龍果酒特性的影響還未見有相關報道。

火龍果是一種廣泛分布于我國南方地區的水果品種，包括紅皮白肉、紅皮紅肉和黃皮白肉3種，富含多種營養物質[10]。貴州省2001年開始引種試種，作為全省農村產業革命重點發展的水果之一，截至2018年，全省火龍果總產量為4.6萬噸，產值達4.1億元。羅甸火龍果和關嶺火龍果也已成為國家地理標志產品，受到國家層次的保護。由火龍果發酵生產的火龍果酒，香氣獨特，口感較佳，且兼具保健功能，深受消費者的喜愛[11]。但目前火龍果酒發酵菌株通常采用葡萄酒活性干酵母，菌株品種有限，發酵酒體單一，同質化較為嚴重。采用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵，可較好的解決這一問題。因此，本研究采用非釀酒酵母Mp與Sc共接種，進行混合發酵，分析其對火龍果酒品質特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅心火龍果：貴州省安順市關嶺縣；賴氨酸固體培養基、WL營養瓊脂鑒定培養基（Wallerstein laboratory nutrient agar）：貴州博奧瑞杰生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純；Mp：中國工業微生物菌種保藏管理中心；Sc ZYMAFLORE X16（簡稱X16）：法國LAFFORT公司。

1.2 儀器與設備

UH5300紫外分光光度計：日本日立公司；雷磁PHSJ-3F pH儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；SA408B電子舌味覺系統：日本Insent公司；TQ8040NX氣相質譜聯用儀（GC-MS）：日本島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone eextrose medium，YEPD）（酵母浸粉 10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L）活化-80℃保存的Mp、Sc菌株。挑取Mp、Sc單克隆分別接種于YEPD液體培養基中，28℃，180 r/min培養24 h，備用。

1.3.2 發酵條件

取新鮮火龍果，去皮，打漿，調整糖度為24°Brix，pH值為3.5，加入40 mg/L二氧化硫、200 mg/L果膠酶，過夜處理。分裝處理后的火龍果漿至2 L無菌三角瓶中，裝量為70%。將培養好的Mp、Sc接種至火龍果漿中，使其Mp終濃度為107cfu/mL，Sc終濃度為106cfu/mL。接種方式為Mp+Sc組共同接種Mp和Sc菌株，Sc組單獨接種Sc菌株。接種后，插上呼吸器，密封，室溫（24℃）放置12 h。待發酵啟動后，轉移至18℃冷庫中，靜置發酵 16 d。分別在發酵的第 0、2、4、8、12、16 天取樣，（1）稱重，計算 CO2釋放率；（2）測定 pH 值；（3）經適當濃度梯度稀釋后，分別涂布在賴氨酸培養基和上，培養48 h計數，從而分析Mp、Sc菌株細胞個數。發酵結束后，離心，取上清液，分別用于常規理化指標、電子舌和氣相質譜聯用儀（gas phase mass spectrometer，GC-MS）檢測。

1.3.3 測定條件

1.3.3.1 火龍果酒常規理化指標測定

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定火龍果酒中乙醇體積分數、pH值、總酸、總糖。

1.3.3.2 火龍果酒感官特性測定

取80 mL火龍果酒樣品至電子舌檢測燒杯中。按照儀器說明書步驟，進行火龍果酒感官特性的檢測。采樣時間120 s，采樣速度為1次/s，每個樣品平行測定3次。

1.3.3.3 火龍果酒揮發性香氣特性測定

采用頂空固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）技術提取火龍果酒香氣成分，參考李凱等方法對火龍果酒揮發性香氣物質進行分析[11]。以環己酮為內標，采用內標法進行物質的定量分析。

1.3.4 數據整理與統計分析

采用Microsoft Excel 2010整理試驗數據，并以平均值±標準差形式表示。采用SPSS 21.0軟件進行數據顯著性分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 火龍果特性

釀造原料紅心火龍果采摘于2018年9月貴州省安順市關嶺縣，顏色粉紅色，糖度為（9.1±0.01）°Brix，pH 值為 3.41±0.01（圖 1）。

圖1 本研究所用紅心火龍果Fig.1 Red pitaya used in this study

2.2 菌株生長特性

Mp和Sc以共接種的形式進行混合發酵火龍果酒，各菌群變化趨勢如圖2所示。

在發酵前4 d，非釀酒酵母Mp在總的酵母菌群中占較大的百分比，但其比例在不斷降低，在發酵第8天基本上檢測不到Mp菌群，發酵液中主要為Sc，一直維持到發酵結束。而釀酒酵母Sc隨著發酵的不斷進行，其菌群數量在不斷增多，在發酵的第4天，在發酵液中所占比例超過Mp，并繼續增加，在發酵第8天基本上很難檢測到Mp菌群。

圖2 共接種發酵火龍果酒酵母菌群動態變化Fig.2 Dynamic changes of yeast population in pitaya wine fermentation with co-inoculation

2.3 pH值、CO2釋放率動態變化

龍果酒發酵過程中pH值和CO2釋放率動態變化見圖3。

圖3 火龍果酒發酵過程中pH值和CO2釋放率動態變化Fig.3 Dynamic changes of pH and CO2emission rate using Sc or Mp+Sc

在火龍果酒發酵過程中，CO2釋放率逐漸增大，且混菌發酵組（Mp+Sc）CO2釋放率要高于Sc組，在發酵的第4天達到最大值。接著逐漸降低，在第8、12、16天，兩組CO2釋放率基本一致（圖3A）。

隨著火龍果酒的發酵，發酵液pH值在發酵前期（前 4 d）逐漸降低，發酵中后期（4 d～16 d）又增加，表現出先降低后增加的趨勢。但變化幅度不大。發酵初始pH值為5.0，在第4天，Sc發酵液pH值為3.3，Mp+Sc發酵液pH值為3.4。發酵結束的第16天，兩組發酵液pH值均又增大到3.5（圖3B）。

2.4 混合發酵火龍果酒基本理化指標

Mp與Sc混合發酵火龍果酒基本理化指標如表1所示。

表1 火龍果酒理化指標Table 1 Physical and chemical indicators of pitaya wine

與商業化釀酒酵母Sc組相比，混合發酵火龍果酒的乙醇體積分數、pH值、總糖3個指標與Sc組發酵火龍果酒沒有區別。但混合發酵火龍果酒揮發酸顯著低于純種Sc發酵火龍果酒。

2.5 混合發酵火龍果酒感官特性

采用電子舌傳感器，從酸味、苦味、澀味、后味、鮮味、咸味等方面分析Mp與Sc混合發酵對火龍果感官特性的影響。火龍果酒滋味屬性雷達圖見圖4。

圖4 火龍果酒滋味屬性雷達圖Fig.4 Pitaya wine taste attribute radar chart

結果如圖4所示，混合發酵火龍果酒酸味測定值顯著小于Sc純種發酵火龍果酒（P<0.05）。其它感官數值Mp+Sc組與Sc組之間無顯著區別。

2.6 混合發酵火龍果酒香氣特性

采用頂空固相微萃取-氣質聯用方法分析Mp與Sc混合發酵對火龍果香氣特性的影響。火龍果酒中揮發性物質種類及含量見表2。

結果如表2所示，Mp+Sc混合發酵火龍果酒中共檢測出46種揮發性物質成份，包括酸類物質3種、醇類物質16種、酯類物質18種、醛酮類物質3種、烴類物質2種、其它類物質4種；Sc純種發酵火龍果酒中僅檢測到39種揮發性物質，包括酸類物質3種、醇類物質13種、酯類物質16種、醛酮類物質2種、烴類物質2種、其它類物質3種。其中在醇類物質、酯類物質、醛酮類物質、其它類物質方面Mp+Sc混合發酵均增加了物質的種類。

表2 火龍果酒中揮發性物質種類及含量Table 2 The aroma substances and their contents in pitaya wine

續表2 火龍果酒中揮發性物質種類及含量Continue table 2 The aroma substances and their contents in pitaya wine

盡管Mp+Sc混合發酵火龍果酒中酸類物質和烴類物質的種類均比Sc組增加，但這些類物質總量卻未增加。Mp+Sc組、Sc組酸類物質總量分別為（2.84±0.14）、（2.42±0.23）mg/L，烴類物質總量分別為（0.51±0.04）、（0.34±0.03）mg/L。另外，Mp+Sc混合發酵火龍果酒中既增加了酯類物質、醛酮類物質、其它類物質的種類和含量。

醇類是酒類中含量較高的一類化合物，主要呈現出清香和清鮮香氣。混合發酵增加了醇類物質種類，Mp+Sc發酵火龍果酒中檢測到16種醇類物質，比Sc單獨發酵多3種。但混合發酵并未增加醇類物質總量，相反醇類物質總量低于Sc純種發酵火龍果酒，兩種發酵火龍果酒中醇類物質總量分別為（27.61±1.31）mg/L和（30.46±1.72）mg/L（圖 5）。

圖5 火龍果酒中揮發性物質含量Fig.5 Contents of aroma substances in pitaya wine

高級醇，又稱雜醇油，是碳原子數大于2的脂肪族醇類的統稱。分析發現，Mp+Sc混合發酵火龍果酒中高級醇的含量也較Sc發酵火龍果酒中低。

酯類物質是各種酒中主要呈香物質之一，閾值一般較低，常具有各種花香和水果香。在2種火龍果發酵果酒中主要的酯類物質均為辛酸乙酯、己酸乙酯和葵酸乙酯，在Mp+Sc混合發酵火龍果酒中其占酯類物質比例分別為49.36%、20.02%、19.35%，在Sc純種發酵火龍果酒中其占酯類物質比例分別為51.40%、23.09%、16.59%。辛酸異戊酯、δ-己醇內酯和N-甲氧羰基-L-脯氨酸十八烷基酯是Mp+Sc混合發酵火龍果酒中特有酯類物質；3-甲基-2-丁烯-1-基-丁酸酯是Sc純種發酵火龍果酒中特有酯類物質。混合發酵火龍果酒中酯類物質總量高于Sc純種發酵火龍果酒中含量。

風味活性值（odour activity value，OAV）為香氣物質濃度與該物質閾值的比值，用來評價食品中香氣物質的貢獻度。一般OAV>1，認為該物質對香氣成分有著突出的貢獻度。反之，OAV<1，認為該物質對香氣成分貢獻度不大。分析了2種發酵火龍果酒中19種主要的揮發性香氣物質OAV值，見表4。

表4 火龍果酒中主要香氣物質OAVTable 4 The OAV of main aroma substances in pitaya wine

發現OAV>1的物質有13種，OAV<1的有6種。在Mp+Sc混合發酵火龍果酒中OAV>1的有12種，OAV值最大的是辛酸乙酯，為4 080.81，OAV<1有7種，OAV值最小的為丁二酸二乙酯，為0.01。

3 討論與結論

由于NSc最初是在變質的葡萄酒中分離出來的，因此，傳統觀點認為其為葡萄酒釀造中的腐敗菌群，一直未受到重視。但越來越多的研究表明，NSc在葡萄酒、多種果酒的酒體形成過程中發揮積極作用，有助于增加酒體的豐富性和感官特性[12]。因此，近年來對NSc生物多樣性、釀酒特性及相關應用研究成為國內外的研究熱點之一。其研究領域也由葡萄酒領域拓展到多種果酒領域，如刺梨果酒[13]、野櫻莓果酒[14]、柿子果酒[15]、蜜桔果酒[16]等。但NSc對火龍果酒品質的影響還未知。本研究以Mp與Sc共接種的方式進行了火龍果酒的發酵，以Sc純種發酵為對照，結果表明，Mp與Sc混合發酵降低了火龍果酒中揮發酸的含量，增加了揮發性物質的種類和含量，如酯類、醛酮類、烴類等，使得酒體豐富度更加復雜。

研究表明，Mp中的某些菌株可分泌多種酶類，如果膠酶、蛋白酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、亞硫酸鹽還原酶、木聚糖酶、脂肪酶等，其中一些酶作用于相關底物，有助于風味物質的釋放[6，17-18]。本研究發現，采用Mp與Sc混合發酵增加了多種酯類物質的種類和含量，以及多種醇類物質的種類。這可能與Mp分泌的一些酶類相關，因此，在后續的研究中，將深入分析所用Mp菌株酶學特性，剖析揮發性香氣物質產生機理。

本研究還進一步分析了混合發酵過程中Mp菌群動態變化，發現隨著發酵的不斷進行，Mp在發酵菌群中所占比例逐漸降低，在發酵第4天所占比例低于50%，在發酵的第8天開始，發酵液中很難檢測到Mp菌群了。通常情況下，Mp對酒精較為敏感，對酒精的耐受性較差，隨著酒精發酵的不斷進行，逐漸死亡，故Mp主要在酒精發酵的前期發揮作用，產生多種揮發性物質，豐富酒體。因此，研究報道，采用Mp與Sc混合發酵有助于降低發酵酒的乙醇含量，可用于低度果酒的生產[19]。但本研究中，混合發酵火龍果酒乙醇含量與Sc純種發酵火龍果酒相比，未見有顯著區別，可能與菌株本身特性，或者接種方式有關。

此外，Mp還可產生抗菌物質普切明（pulcherrimin），通過競爭性吸收環境中的鐵離子，抑制其它微生物對鐵離子的需求，可作為一種光譜性抗菌劑[20-22]。因此，在果酒生產中，采用Mp作為生產菌種，通過生物防控，可有效抑制野生雜菌，減少二氧化硫的使用量。

綜上，本研究首次分析了Mp與Sc混合發酵對火龍果酒特性的影響。結果表明，Mp與Sc混合發酵可有效降低火龍果酒中揮發酸含量，增加酒體中酯類、醇類、醛酮類、烴類等揮發性物質的種類，降低了酸類、醇類物質的含量。此外，Mp與Sc混合發酵還降低了酸味感官特性。因此，Mp與Sc混合發酵是一種可以推薦的火龍果酒的生產方式，既增加了酒體的復雜度，又降低了同質化現象。但本研究僅分析了Mp與Sc混合發酵的一種接種方式，一種接種比例，更多的發酵方式還需要分析比較，從而確定較優的生產方式。