超聲輔助提取花生根多酚工藝優(yōu)化及組成分析

楊文娟，侯旭杰，，阿依古麗·吾斯曼，侯文鑫，郭芹，蒲云峰，*，王強(qiáng)*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

多酚一般指多酚類化合物，包括復(fù)合多酚、黃酮類化合物、花青素等[1]。多酚多存在于谷物[2]、堅(jiān)果類[3-4]、水果，如葡萄、茶葉、綠豆[5-7]中，并且含量豐富。研究表明，多酚在藥理方面具有很強(qiáng)的抗氧化性、降低血脂、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能活性[8-15]，有促進(jìn)人體健康的作用。因多酚極強(qiáng)的抗氧化活性被稱為“第七類營養(yǎng)素”[16]。目前常見的多酚提取工藝有溶劑提取法、微波輔助提取法、分光光度法和高效液相色譜法等[17]。

花生是我國的主要油料作物之一。花生副產(chǎn)物中存在大量的多酚類物質(zhì)，目前，許多研究者從花生的殼和紅衣中提取多酚[18-19]，以及從花生的根、莖、葉、紅衣、殼中提取白藜蘆醇、原花青素、木犀草素等[20-24]。花生中的多酚類物質(zhì)除了白藜蘆醇、原花青素等還存在許多其它的酚類物質(zhì)，如茶多酚、p-香豆酸等，都具有相同的抑菌、防輻射等效果。但在花生根的多酚類物質(zhì)提取方面研究較少，目前常見的是在花生根中提取白藜蘆醇[22]，因此本研究以花生根為原料，探究花生根中的多酚含量，以及檢測花生根中多酚類物質(zhì)的主要成分。本研究給花生副產(chǎn)物中多酚的提取提供了更多理論依據(jù)。提取花生根中的多酚類物質(zhì)不僅提高了花生根的綜合利用價值和經(jīng)濟(jì)價值，也使花生的各個部位都更加有效地利用起來，而且為進(jìn)行針對性的藥物和保健食品的開發(fā)應(yīng)用提供原材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生根：塔里木大學(xué)種植的花生試驗(yàn)田；甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、p-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海源葉生物科技公司；福林酚試劑（2 mol/L）：美國米瑞達(dá)科技有限公司；無水乙醇：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；無水碳酸鈉（≥99.8%）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV-2450）、高效液相色譜儀（LC-20A）：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；高速冷凍離心機(jī)（TGL-20br）：上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX9240MBE）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超聲波清洗機(jī)（SB-5200DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；無篩粉碎機(jī)（SZNL-150）：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

將從試驗(yàn)田收獲的花生根洗凈、烘干、用高速萬能粉碎機(jī)粉碎后過60目篩。裝瓶放置干燥處留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 花生根中多酚提取的工藝流程

稱取花生根粉末 1.0 g，按料液比 1∶30（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，置于超聲波清洗器中，超聲頻率40 kHz、功率為200 W、在一定溫度下超聲處理一段時間后，經(jīng)離心機(jī)4 000 r/min離心10 min。取上清液用無水乙醇稀釋5倍，即得多酚提取液。

1.3.3 花生根中多酚含量的測定

1.3.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用水溶解并定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。取15 mL具塞試管，先加入一定量水（標(biāo)準(zhǔn)品和80%水的總體積為10.2mL）分別準(zhǔn)確移取該溶液 0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，再分別加入0.3 mL福林酚試劑，反應(yīng)5 min后加入1mL 15% Na2CO3溶液，加蓋搖勻，避光條件下反應(yīng)2 h，以無水乙醇為空白對照，在745 nm處測定吸光度，得到回歸方程y=0.956 1x+0.123 5，R2=0.999 1，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

1.3.3.2 多酚的測定

具塞試管中加入10 mL超純水，再加入0.2 mL樣液和0.3 mL福林酚試劑反應(yīng)5 min后，加入1 mL 15% Na2CO3溶液，搖勻于室溫24℃下避光反應(yīng)2 h，在745 nm處測定吸光度值，算出多酚提取量，單位為mg/g。

1.4 單因素試驗(yàn)

分別考察乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比[1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、提取溫度（30、35、40、45、50℃）4個因素對花生根中多酚提取量的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 正交試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，分別考察A乙醇體積分?jǐn)?shù)、B料液比、C提取溫度、D超聲時間因素，得到最佳工藝。設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)表。

1.6 花生根中多酚成分分析

1.6.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：280 nm；流動相：A為甲醇，B為0.5%甲酸；總時長：60 min；流速：0.7 mL/min。

1.6.2 洗脫條件（320 nm和280 nm）

流動相：流動相A為甲醇，流動相B為0.5%甲酸。洗脫程序：0～6 min，B 為 90%；6 min ～10 min，B為 90%～80%；10 min～11 min，B 為 80%；11 min～15 min，B 為 75%～70%；15 min～25 min，B 為 70%～60%；25 min～32 min，B 為60%～45%；32 min～40 min，B 為 45%～0%；40 min～50 min，B 為 0%；50 min～51 min，B 為 0%～90%；51 min～60 min，B為90%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花生根中多酚提取量影響

稱取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超聲波清洗器中，30℃下超聲輔助提取30min，在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%條件下分別進(jìn)行多酚提取，提取量如圖2所示。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on polyphenol extraction

如圖2所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50% ～70%時，花生根中多酚提取量與乙醇體積分?jǐn)?shù)為正相關(guān)，在70%時，提取量達(dá)到最大值。乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%后多酚提取量呈逐漸遞減趨勢。乙醇體積分?jǐn)?shù)可能會影響多酚的溶解度[25]。乙醇的體積分?jǐn)?shù)增加，花生根中脂溶性物質(zhì)和醇溶性物質(zhì)溶出量增加，使多酚與乙醇-水分子結(jié)合量降低，從而使多酚的提取量降低。

2.1.2 料液比對多酚提取量的影響

稱取1.0 g花生根粉末，取體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，按照料液比分別為 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）分別置于超聲波清洗器中，30℃下超聲輔助提取30 min。所得多酚的提取量如圖3所示。

由圖3可知，多酚的提取量隨著溶劑體積的增加而逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時多酚的提取量達(dá)到最大值。這是由于乙醇的質(zhì)量越大，多酚的溶出率則越高。出于經(jīng)濟(jì)效益，選取料液比為1∶30（g/mL）時為最佳。

2.1.3 提取溫度對多酚提取量的影響

圖3 料液比對多酚提取量的影響Fig.3 Effect of the liquid ratio on polyphenol extraction

稱取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超聲波清洗器中，超聲輔助提取 30 min，分別在提取溫度為 30、35、40、45、50 ℃的條件下，進(jìn)行多酚的提取，多酚的提取量如圖4所示。

圖4 提取溫度對多酚提取量的影響Fig.4 Effect of the extraction temperature on polyphenol extraction

由圖4可知，溫度在30℃～40℃之間，多酚的提取量與溫度呈正相關(guān)，40℃以后多酚的提取量逐漸下降。這一現(xiàn)象是由于溫度升高分子運(yùn)動加快，溶解速率增加，導(dǎo)致花生根中多酚的溶解量增大。隨著溫度的升高，溶劑揮發(fā)導(dǎo)致溶解度降低提取量下降。因此，提取多酚的最佳適應(yīng)提取溫度為40℃。

2.1.4 超聲時間對多酚提取量的影響

稱取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超聲波清洗器中，提取溫度30℃，考察超聲時間分別在 10、20、30、40、50 min 的條件下對多酚提取量的影響，多酚的提取量如圖5所示。

圖5 超聲時間對多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on polyphenol extraction

如圖5所示，在時間為10 min ～40 min時，提取量與超聲時間呈正相關(guān)。提取量隨著超聲提取時間逐漸增加，當(dāng)超聲時間超過40 min后，超聲波可能會對多酚物質(zhì)造成損失，從而提取量下降。因此40 min時多酚的提取量最佳。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

花生根中多酚的提取正交表見表1。

表1 正交試驗(yàn)表Table 1 Orthogonal table

由表1可知，各因素對提取量的影響大小順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，即當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶30（g/mL）時，在超聲波清洗器中45℃條件下提取50 min得到最優(yōu)組合為A2B2C3D3。由于在正交試驗(yàn)過程中的最佳組合與正交試驗(yàn)所得的最佳組合不同，故需驗(yàn)證試驗(yàn)。

按照正交表中最佳組合A2B2C3D1和正交試驗(yàn)各因素最佳水平組A2B2C3D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到花生根中多酚的平均得量分別為1.497 mg/g和1.629 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.6%和1.9%，均小于5%，表明精密度較好，因此試驗(yàn)最佳組合為A2B2C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度45℃、超聲時間50 min，且最佳提取量為1.629 mg/g。

2.3 花生根多酚提取物的高效液相（high performance liquid chromatography，HPLC）分析結(jié)果

超聲波輔助提取法測得的最佳組合為供試樣液，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度45℃、超聲時間50min時所提取的樣液，用0.22μm微孔濾膜過濾，所得樣液即為待測液，放入進(jìn)行自動進(jìn)樣，并記錄色譜圖。花生根多酚提取物的液相（HPLC）分析見表2。高效液相色譜法對花生根提取物的成分分析見圖6。

表2 花生根多酚提取物的高效液相分析Table 2 High performance liquid chromatography（HPLC）analysis of peanut root polyphenol extract

圖6 花生根多酚提取物分析色譜圖Fig.6 Peanut root polyphenol extract analysis chromatography

從表2、圖6中可以看出，花生根中多酚提取物在波長為278 nm下檢測到了兒茶素（1號峰），在波長為310 nm～317 nm之間檢測出了白藜蘆醇（4號峰）、p-香豆酸（3號峰）、咖啡酸（2號峰），在花生根中檢測出的多酚類物質(zhì)中p-香豆酸和咖啡酸含量相對較少。提取物中還有許多多酚類物質(zhì)（5號峰），他們的最大吸收波長都在310 nm～317 nm之間。

3 結(jié)論

使用超聲輔助提取法來提取花生根中的多酚，得到的優(yōu)化工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度 45℃、超聲時間 50 min，此條件下得到的花生根中多酚含量為1.629 mg/g。用高效液相色譜法測定花生根提取物可以得出兒茶素、白藜蘆醇、咖啡酸、p-香豆酸4種單體酚，提取物中還有許多多酚類物質(zhì)，其最大吸收波長都在310 nm～317 nm之間。通過提取花生根中的多酚不僅提高了花生副產(chǎn)物的綜合利用量，為化妝品、藥品行業(yè)提供原材料，而且使花生的各個部位更加有效的利用起來，物盡其用。