響應面法優化藍靛果酒低溫二氧化碳浸漬工藝

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

藍靛果（Lonicera caerulea），忍冬科，忍冬屬[1]。藍靛果果實中維生素、有機酸、礦物質等營養成分含量豐富，并且含有多種抗氧化成分如黃酮、多酚、單寧及花色苷等[2-3]，對人體具有保健功能。因其口味酸澀，很少用來直接食用，此外由于藍靛果果皮較薄易破碎，一般以冷藏為主，而冷藏會影響其風味，因此常加工成果汁、果酒等產品，是果汁、果酒釀造的一類新興原料。

目前藍靛果酒的釀造一般采用傳統的清汁發酵，采用清汁發酵時，果皮中的芳香成分、花色苷等酚類物質浸提不充分，容易導致果酒色度低、風味差等問題[4]。

低溫浸漬是在10℃以下的環境下浸漬，低溫能夠抑制果皮上野生酵母的繁殖，延緩發酵時長，從而有效促進藍靛果中的酚類物質、花色苷等成分的浸出，提取出更多的香氣成分和呈現較深的顏色，提升果酒品質，但卻不容易控制時間，導致劣質單寧等成分的浸出[5-6]。CO2浸漬工藝是將果實處于無氧條件下進行細胞內發酵和浸漬作用，此過程中有少量酒精的產生、酚類等物質的浸出以及有機酸的轉化與產生等一系列反應[7-8]。裴辰玉等[9]研究表明常溫（28℃）下的CO2浸漬手段釀造的果酒總酸和單寧含量低，口味更柔和，但酒體較為單薄不宜長時間貯藏。對于低溫浸漬和CO2浸漬工藝釀造果酒的研究很多，但是將低溫和CO2浸漬結合在一起的研究卻鮮有報道。張軼斌等[10]采用低溫CO2浸漬新工藝釀造玫瑰香紅葡萄醋，證明了低溫CO2浸漬新工藝在保留了花色苷等多酚類物質的同時，能降低產品中單寧和總酸的含量。常溫（28℃）下CO2浸漬要求果實的完整性，但由于藍靛果皮較薄易破碎，溫度過高容易導致其腐敗變質，影響果酒品質[11]。而在低溫條件下可以抑制野生酵母的繁殖以及雜菌的生長，解決了果皮破損的問題。因此本文采用低溫CO2浸漬工藝釀造藍靛果酒，解決藍靛果總酸和單寧含量高、酚類物質浸出差以及原料破損等問題。以期提高藍靛果酒的品質，從而豐富果酒市場的需求，為藍靛果酒的釀造提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

藍靛果：黑龍江省七臺河市勃利縣人工培育的“蓓蕾”品種。

1.1.2 主要試劑

RC212酵母：煙臺帝伯仕自釀有限公司；CO2氣體：吉林燃料乙醇有限公司；白砂糖：市售；氫氧化鈉、鹽酸、沒食子酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、碳酸鈉、無水乙醇、福林酚試劑（均為分析純）：天津市恒興化學制造有限公司。

1.2 主要儀器

5 L不銹鋼壓力桶：深圳市歐亞娜電子設備有限公司；TG16-WS型高速離心機：黑龍江嘉禾廣博進出口有限公司；V-5200型紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；Sartorious PB 10 pH計：廣州市深華生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

挑選藍靛果→無菌操作臺滅菌15 min→低溫CO2浸漬→壓榨、過濾→成分調整→添加偏重亞硫酸鉀→主發酵9 d→后發酵25 d→陳釀→滅菌→成品[12]

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 原料處理

選用成熟、無蟲害的藍靛果果實作為原料，保持原料完整，在無菌操作臺進行滅菌后將藍靛果放入不銹鋼壓力桶中。

1.3.2.2 浸漬處理

將藍靛果緩慢送入發酵罐底，裝罐密封后，充入CO2氣體調整壓力，并放在冰箱（0℃ ～10℃）進行浸漬。浸漬結束后，給發酵罐升溫至26℃，進行后續發酵試驗。

1.3.2.3 發酵液調配

將浸漬后的藍靛果漿進行壓榨、過濾，得到的果汁加入白砂糖調節糖濃度為200 g/L，加入檸檬酸調節pH值為3.5。再加入0.2 g/L的偏重亞硫酸鉀，6 h后接種酵母。

1.3.2.4 果酒酵母活化

將活性干酵母RC212用接種針挑取少量的菌株接種到10 mL的麥芽浸汁液體培養基中，后于28℃的培養箱中培養24 h進行菌種活化。活化后的菌株在麥芽浸汁固體培養基上進行3次劃線傳代后接種到斜面培養基上，于4℃下低溫保藏。取傳代后的菌株接種于100 mL的麥芽浸汁液體培養基中于28℃的培養箱中，培養24 h制成酵母菌母液，4℃下保藏，以做后續試驗使用。

1.3.2.5 發酵條件

浸漬處理后的發酵條件：發酵溫度為26℃，接入2%（體積比）的酵母菌活化液，發酵10 d結束。

1.3.3 單因素試驗條件的選取

浸漬發酵后測量果酒中總酸、單寧和花色苷的含量，以感官評分為主要評價指標，綜合考慮選取較優單因素條件[13]。控制浸漬溫度為6℃，浸漬壓力為0.1MPa，浸漬時間設置為 1、3、5、7、9 d。控制浸漬時間為 5 d，浸漬壓力為 0.1 MPa，浸漬溫度設置為 2、4、6、8、10 ℃。控制浸漬時間為5 d，控制浸漬溫度為6℃，浸漬壓力設置為 0、0.05、0.1、0.15、0.2 MPa。

1.3.4 響應曲面優化設計

在單因素試驗的基礎上，選取較優的參數范圍進行響應面分析，以藍靛果酒的感官評分為響應值，篩選出低溫CO2浸漬工藝的最優條件。各因素的處理水平如表1所示。

表1 響應曲面設計因素及水平Table 1 Response surface design factors and levels

1.3.5 不同工藝發酵對比試驗

經響應面優化驗證后，與傳統工藝和常溫二氧化碳浸漬作對比。控制常溫CO2浸漬與低溫CO2浸漬工藝壓力相同，CO2浸漬溫度為28℃，傳統工藝采取清汁發酵。將幾種不同前處理得到的果汁進行發酵試驗，發酵條件與1.3.2.5相同，發酵結束后測定相關理化指標，并進行感官評價。

1.3.6 相關指標測定方法

1.3.6.1 基本理化指標的測定

總酸（檸檬酸計）：pH電位法；總糖：直接滴定法；酒精度：蒸餾-比重法，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.6.2 單寧、總酚、花色苷含量的測定

單寧：分光光度法，參照NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定》；總酚：福林-酚法[14]；花色苷：pH 示差法[15]；色度的測定：分光光度法[16]。

1.3.6.3 感官評價

選取28名優質品評員通過對果酒的色澤、滋味、香氣及典型性進行評定，感官質量評分標準見表2。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官分析方法進行評價。

表2 感官評分表Table 2 Sensory score form

1.4 數據處理

所得數據均為3次試驗的平均值，采用Origin8.0軟件作圖、Design-Expert8.0.6軟件進行響應面分析以及SPSS 23.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 浸漬條件單因素試驗結果分析

單寧是果酒的靈魂，為果酒建立“骨架”，保證酒體結構穩定豐滿。但過多的單寧會增加果酒的澀度，影響口感[17]。花色苷在果酒中起呈色作用，會與單寧等物質相互作用形成聚合物來增強顏色[18]。總酸含量的高低影響果酒的酸度。因此單寧、總酸和花色苷的含量對果酒的感官品質具有一定影響。

2.1.1 不同浸漬時間對藍靛果酒的影響

浸漬時間對藍靛果酒理化指標及感官的影響見圖 1、圖 2。

圖1 不同浸漬時間對藍靛果酒理化指標的影響Fig.1 The influence of different impregnation time on the physical and chemical index of Lonicera caerulea wine

圖2 不同浸漬時間對藍靛果酒感官品質的影響Fig.2 The effect of different impregnation time on the sensory quality of Lonicera caerulea wine

由圖1可知，總酸含量隨時間的增長，呈先降低后升高的趨勢，在第5天總酸含量最低為13.1 g/L，與1 d ～3 d及第9天具有顯著性差異（P<0.05）。這是由于浸漬前期，發生細胞內發酵，CO2促進了蘋果酸的轉化，導致總酸含量降低，而隨著時間的增長，乳酸和CO2生成，部分CO2溶于藍靛果汁中，從而提高了果酒中的總酸含量。隨著浸漬時間的增長，單寧含量總體呈先增加后減少的趨勢，在第3天含量最高，在1 d ～5 d時，單寧呈顯著增長的趨勢（P<0.05），在5 d ～9 d下降趨勢平緩，無顯著性差異（P>0.05）。這可能是由于浸漬前期，CO2進入果實中較少，并且低溫抑制細胞內發酵，導致細胞內發酵不顯著，隨著時間的延長，無氧呼吸產生酒精，與果皮能夠充分接觸，導致單寧浸出，后期降低可能是由于發生酶解或者是與花色苷等成分發生聚合，導致單寧含量降低。花色苷整體呈先升高后降低的趨勢，在第5天的含量最高為435 mg/L，與其它幾天具有顯著性差異（P<0.05）。這是由于浸漬前期，發生細胞內發酵，花色苷逐漸溶出。隨著時間的延長，部分花色苷發生降解，導致其溶解性降低而沉降下來，從而含量降低。

由圖2可知，浸漬5 d得到的藍靛果酒感官評分最高，與其它幾天具有顯著性差異（P<0.05），所得到的果酒酸甜適中，口感柔和，酒體飽滿，色澤穩定。這是由于在浸漬第5天總酸含量最低，花色苷含量最高，適量的單寧保證了酒體飽滿且不苦澀。綜合分析，確定第5天為最佳浸漬時間。

2.1.2 不同浸漬溫度對藍靛果酒的影響

浸漬溫度對藍靛果酒理化指標及感官的影響見圖 3、圖 4。

圖3 不同浸漬溫度對藍靛果酒理化指標的影響Fig.3 The influence of different impregnation temperature on the physical and chemical index of Lonicera caerulea wine

由圖3可知，隨著溫度的升高，總酸呈逐漸降低的趨勢（P<0.05）。這可能是由于低溫抑制了細胞內發酵，隨著溫度的升高，促進了蘋果酸等有機酸的轉化，導致總酸含量的降低。單寧含量逐漸增加，這是由于隨著浸漬溫度的升高促進了細胞內發酵以及果膠酶解，單寧溶出增多。花色苷整體呈先升高再降低的趨勢，在溫度為6℃時含量最高，與其它溫度具有顯著性差異（P<0.05）。這可能是由于溫度升高，促進了酶解以及細胞內發酵，花色苷更好地溶出，但花色苷不穩定，高溫下容易發生降解或聚合，從而含量降低。

圖4 不同浸漬溫度對藍靛果酒感官品質的影響Fig.4 The effect of different impregnation temperature on the sensory quality of Lonicera caerulea wine

由圖4可知，6℃時感官評分最高，與其它溫度具有顯著性差異（P<0.05）。所得到的果酒酸甜適中，果香濃郁，顏色呈亮紅色。這是由于適宜的溫度能降低總酸含量，保證花色苷溶出較多，溫度較低時，單寧、花色苷等酚類物質浸出不足，酒體單薄，過高的溫度容易使劣質單寧浸出導致口感苦澀，影響感官品質。綜合分析，選擇6℃為最佳浸漬溫度。

2.1.3 不同浸漬壓力對藍靛果酒的影響

浸漬壓力對藍靛果酒理化指標及感官的影響見圖 5、圖 6。

圖5 不同浸漬壓力對藍靛果酒理化指標的影響Fig.5 The influence of different impregnation pressure on the physical and chemical index of Lonicera caerulea wine

圖6 不同浸漬壓力藍靛果酒感官評分的影響Fig.6 The effect of different impregnation pressure on the sensory quality of Lonicera caerulea wine

由圖5可知，隨著壓力的增大，總酸含量呈先降低后升高的趨勢，在壓力為0.15 MPa時總酸含量最低為12.7 g/L，在0 ～0.1 MPa顯著下降（P<0.05）。這是由于CO2含量的增加促進了部分有機酸的分解和蘋果酸的轉化，但隨著CO2的增加，細胞內發酵增強，乳酸等有機酸含量增加，以及過多的CO2溶解在藍靛果汁中生成碳酸導致總酸含量增加。隨著壓力的增長，單寧含量呈逐漸上升的趨勢，在0 ～0.1MPa顯著上升（P<0.05），0.1 MPa ～0.2 MPa上升較為緩慢（P>0.05）。這是由于細胞內發酵增強，細胞內發酵產生酒精，過高的壓力導致果實容易發生破裂，產生的酒精和浸漬出的果汁與果皮充分接觸，果實內部的單寧逐漸浸出。花色苷含量呈先升高后降低的趨勢，浸漬壓力為0.1 MPa時花色苷含量最高。

由圖6可知，0.1 MPa時感官評分最高，所得到的果酒色澤明亮、酸甜適中、果香濃郁。這是由于適當的壓力在保證花色苷溶出較多的同時，降低了總酸和單寧含量，提升了果酒品質。綜合分析，選擇0.1 MPa為最佳浸漬壓力。

2.2 響應面優化

2.2.1 響應面設計及結果

響應面試驗結果如表3所示。

表3 響應面設計及結果Table 3 Responsive design and results

2.2.2 回歸模型及方差分析

依據試驗數據進行多元回歸分析，可得到3個因素對藍靛果酒感官品質影響的二次回歸模型：R=-6.86231+14.34A+14.47B+296.685C-0.31AB+1.925AC-13.825BC-1.43A2-0.99B2-995.3C2。對所得回歸模型進行方差分析，如表4所示。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance in regression model

由表4回歸模型分析可知，P<0.000 1，該響應曲面的二次多元回歸模型極顯著，失擬項P=0.164 2>0.05，不顯著，由此可得該回歸模型具有好的擬合程度。模型的復相關系數為0.985 9>95%，可知因變量對自變量的影響顯著。校正決定系數為0.995 6，說明該模型擬合度較好，可以進一步分析。

一次項 A、C 和二次項 A2、B2、C2極顯著（P<0.01），一次項B顯著（P<0.05）。考察各因素交互作用，AB、AC、BC存在交互作用，其中BC差異極顯著（P<0.01），AB差異顯著（P<0.05），AC差異不顯著（P>0.05）。根據F值可知，在試驗范圍內各因素對藍靛果酒感官評分的影響依次為：A（浸漬時間）>C（浸漬壓力）>B（浸漬溫度）。

2.2.3 響應曲面分析與討論

各因素及其交互作用對感官品質影響的響應面見圖7。

根據響應曲面趨勢及等高線的密集程度，判斷各因素之間的交互作用。響應曲面的趨勢越陡，等高線越密集，說明兩兩交互越顯著。由圖7可知，3D響應曲面陡峭，并且等高線均呈橢圓形，說明各因素之間交互作用顯著，其中圖7a和圖7c的曲面趨勢較陡，圖7b的趨勢略微平緩，這說明時間和溫度以及溫度和壓力交互作用較為顯著，這與方差分析結果一致。

圖7 兩因素交互作用的響應曲面圖Fig.7 Response surface plot of the interaction of each two factors

2.2.4 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0軟件計算最優點，獲藍靛果酒的最優浸漬工藝為：浸漬時間5.62 d，浸漬溫度5.60℃，浸漬壓力0.12 MPa，在此條件下預測其感官評分為91.086 7分，按照實際情況調整浸漬條件為：浸漬時間5.6 d，浸漬溫度6℃，浸漬壓力0.1 MPa。為驗證響應面優化工藝結果可靠性，進行3組平行試驗驗證，得出在此條件下其感官評分分別為91.10、90.98、91.07分，說明優化效果顯著，進一步證明該回歸模型是有效可靠的。

2.3 不同工藝對比試驗

不同工藝藍靛果酒的理化指標及感官評分見表5。

由表5可知，3種工藝對藍靛果酒的殘糖量和酒精度影響不大，無顯著性差異（P>0.05），說明3種工藝生產的果汁對果酒的發酵程度影響較小。傳統工藝總酸含量較高，常溫CO2浸漬和低溫CO2浸漬工藝總酸含量相對較低，這可能是由于通入CO2促進了蘋果酸的轉化，降低了總酸含量，使得口感更柔和，這與Lucía González Arenzana等[19]的研究一致。低溫二氧化碳浸漬產生的總酚含量最高，傳統工藝總酚含量最低。這是由于傳統工藝采取清汁發酵，浸提不充分，酚類物質浸出差，而低溫抑制野生酵母的繁殖，延長了浸漬時間，使得酚類物質更多地浸出[20]。傳統工藝單寧含量較高，CO2浸漬工藝單寧含量較低，這是由于藍靛果直接破碎榨汁，果皮中的劣質單寧直接浸出，這與劉晶等[21]的研究結果一致。單寧是酒體的靈魂，單寧過少會導致酒體單薄無力，過多的單寧則導致口感苦澀，因此利用低溫與CO2的協同作用，保證單寧的適量浸出。低溫CO2浸漬工藝產生的花色苷含量及色度較高，這是由于低溫延長浸漬時間，使得花色苷更好地溶出，并且低溫可以抑制花色苷的分解，從而提升果酒色度。

表5 不同工藝藍靛果酒的理化指標及感官評分Table 5 The physical and chemical indexes and sensory scores of Lonicera caerulea wine with different processes

綜上所述，采用低溫CO2浸漬工藝在保留了花色苷等酚類物質的同時，適量降低了單寧和總酸的含量，解決了傳統工藝與常溫CO2浸漬工藝存在的問題，提升了藍靛果酒品質。

3 結論

以藍靛果為原料，研究浸漬時間、浸漬溫度和浸漬壓力對藍靛果酒理化性質及感官品質的影響，經單因素試驗和響應面的優化，得到低溫CO2浸漬的最佳工藝為：浸漬時間5.6 d、浸漬溫度6℃、浸漬壓力0.1 MPa，此浸漬工藝條件下的藍靛果酒感官評分為91分，口感柔和，香氣宜人，色澤穩定。對比試驗表明，采取低溫CO2浸漬工藝能有效降低單寧和總酸的含量，并能使花色苷等酚類物質充分溶出，提升果酒品質，解決了藍靛果酒口感酸澀，香氣不明顯等問題，具有不同于其它工藝的特殊風味，為藍靛果酒的工業生產提供了理論依據。