苯并噻重氮浸泡處理對金冠蘋果苯丙烷代謝的影響

韓旭，李燦嬰，葛永紅，劉騰，王瑞瑤

（渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013）

蘋果（Malus domestica Borkh）屬于仁果類，是我國產量第一的水果，其中渤海灣地區尤其盛產蘋果，主要品種有富士、金冠、嘎啦等[1]。蘋果果實營養豐富，富含多種維生素、多酚、花青素、膳食纖維、有機酸等[2]。蘋果是典型的呼吸躍變型果實，在采后貯運和銷售過程中極易衰老引起品質下降和腐爛，給生產商和經營商帶來巨大的經濟損失。因此，延緩采后果實的衰老并提高果實抗病能力是蘋果貯藏保鮮亟待解決的問題。

誘導抗性是近年來發展的果蔬采后病害控制的新技術之一，主要是通過激發果蔬自身防御系統，來增強抗氧化能力和抗病性[3]。苯并噻重氮（acibenzolar-S-methyl，ASM），是一種水楊酸的結構類似物，在體外條件下對病原真菌沒有抑制效果，但可誘導蘋果[4-5]、梨[6-7]、甜瓜[8]等果實的抗性，并且能夠保持果實的品質[4]。ASM能夠激活果蔬苯丙烷代謝途徑，促進次生代謝產物酚類和黃酮類的積累[9-11]，還能夠通過調控活性氧和能量代謝延緩果實衰老并提高抗病性[5，7，12-13]。酚類和類黃酮具有重要的抗菌和抗氧化性能，酚類物質還是木質素合成的前體，有助于強化細胞壁，阻止病原真菌的侵染[14]。然而，有關采后ASM浸泡處理對金冠蘋果果實采后次生代謝的影響尚缺乏深入研究。

本研究以金冠蘋果為材料，通過采后ASM浸泡處理，研究常溫貯藏期間苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、肉桂酸-4-羥基化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶活性的變化以及總酚和類黃酮含量的積累，為進一步豐富ASM誘導抗性機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

金冠蘋果（商業成熟度）：采自錦州市蘋果園，人工采摘并挑選成熟度一致、大小一致、表皮無機械損傷和病蟲害的果實。采后用紙箱包裝（50個/箱）后立即運回實驗室，在24℃，相對濕度50% ～60%條件下貯藏待用。苯并噻重氮（acibenzolar-S-methyl，ASM，純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FE 28型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；H1650R型小型冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；UV-1801型紫外分光光度計：北京北分瑞麗分析儀器集團；HH-9A型常溫單列單控水浴鍋：常州國字儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ASM浸泡處理

參照葛永紅等[15]方法并修改。新鮮采摘的蘋果果實先用10 mg/mL次氯酸鈉溶液消毒1 min，蒸餾水沖洗晾干后用0.1 g/L的ASM溶液浸泡處理10 min，用等量蒸餾水處理為對照。所有處理果實室溫（24℃）晾干后分別裝入塑料托盤中（15個/盤），于24℃，相對濕度50% ～60%條件下貯藏待用。每組處理105個果實。

1.3.2 取樣

參照葛永紅等[15]方法，分別于處理后第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天取對照和ASM處理果實果肉樣品，在-80℃的冰箱中貯藏待用。

1.3.3 苯丙氨酸解氨酶（phenylalamine ammonia lyase，PAL）活性測定

參照Liu等[11]的方法。PAL反應體系為3.0 mL硼酸緩沖液（pH8.8，100 mmol/L）、0.5 mL 0.02 mol/L 苯丙氨酸和0.2 mL粗酶液，混勻后于290 nm處測定初始吸光度，在30℃水浴鍋中保溫30 min后立即加入200 μL 6.0 mol/L鹽酸溶液終止反應，再次測定290 nm處吸光度值。以每分鐘吸光度變化0.01為1個活性單位（U），酶活性表示為U/mg蛋白。

1.3.4 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性測定

參照Chen等[16]方法。PPO反應體系為3.0 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚和1.0 mL粗酶液，以滅活的酶液為空白對照，混合均勻后于290 nm處測定初始吸光度，在30℃水浴鍋中保溫10 min后立即加入200 μL 6.0 mol/L三氯乙酸終止反應，再次測定290 nm處吸光度值。以每分鐘吸光度值變化0.01為1個活性單位（U），酶活性表示為U/mg蛋白。

1.3.5 4 -香豆酰輔酶A連接酶（4-coumarate coenzyme A ligase，4CL）活性測定

參照Liu等[11]的方法。4CL反應體系包括0.15 mL 0.8 mmol/mL三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），0.15 mL 1.0 μmol/mL 輔酶 A（coenzyme A，CoA），0.45 mL 75 mmol/L氯化鎂溶液，0.15 mL 2.0 mmol/mL p-香豆酸和0.5 mL上清液（對照不加p-香豆酸），混合均勻后于333 nm處測定其吸光度值，以每分鐘吸光度值變化0.001為1個4 CL活力單位（U），酶活性表示為U/mg蛋白。

1.3.6 肉桂酸-4-羥基化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）活性測定

參照Liu等[11]的方法。C4H反應體系為2.2 mL緩沖液 [2.0 μmol/L反式肉桂酸，50 mmol/L pH8.9 Tris-HCl，2.0 μmol/L 氧化型輔酶Ⅱ二鈉（triphosphopyridine nucleotide disodium salt，NADPNa2），5.0 μmol/L 葡萄糖-6-磷酸-鈉（D-glucose 6-phosphate sodium salt，G-6-P Na）]和0.8 mL上清液，25℃振蕩反應30 min后，加入100 μL 6.0 mol/L鹽酸溶液終止反應，在12 000 r/min、4℃條件下低溫離心10 min，混合均勻后于340 nm處測定其吸光度值，每小時340 nm處OD值變化0.01為1個活性單位（U），酶活性表示為U/mg蛋白。

1.3.7 總酚和類黃酮含量測定

取1 g（鮮重）蘋果，參照Liu等[11]的方法，測定其總酚和類黃酮含量分別以OD280和OD325表示。

1.3.8 蛋白含量測定

參照曹建康等[17]方法，采用考馬斯亮藍染色法測定粗酶液中的蛋白質含量。

1.4 數據處理

所有3次重復的試驗數據采用Microsoft Excel 2007計算平均值和標準誤差并作圖，采用SPSS 16.0統計軟件進行最小顯著性差異分析（least significant difference，LSD）。

2 結果與分析

2.1 ASM處理對果實PAL活性的影響

ASM處理對果實PAL活性的影響見圖1。

PAL是苯丙烷代謝途徑的限速酶，調控果實體內酚類、黃酮類、木質素、水楊酸、生物堿等的生物合成及細胞壁木質化的過程，其活性高低與果蔬的抗病性直接相關[18]。由圖1可知，對照和ASM處理蘋果果實中PAL活性整體呈先上升后下降的趨勢，但對照果實PAL活性整體變化不大，而在貯藏第4天到第12天，ASM處理顯著提高了蘋果果實中PAL活性，并在第8天出現峰值。Cao等[19]研究發現，采前ASM處理誘導了幼果和貯藏期間鴨梨果實PAL活性。采后ASM處理也能夠提高甜瓜[11]和藍莓[20]果實PAL活性，提高其抗病性和抗氧化能力。也有研究表明，采后多聚賴氨酸處理能夠誘導蘋果果實PAL活性的升高[21]。由此說明，誘導PAL活性的升高是ASM誘導果實產生抗病性的主要反應之一。

圖1 采后ASM浸泡處理對蘋果果實苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響Fig.1 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the activity of PAL of apple fruit

2.2 ASM處理對果實PPO活性的影響

ASM處理對果實PPO活性的影響見圖2。

圖2 采后ASM浸泡處理對蘋果果實多酚氧化酶（PPO）活性的影響Fig.2 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the activity of PPO of apple fruit

PPO能夠催化酚類物質轉變成醌，能夠直接抑制或者殺死病原物的生長[22]。隨著貯藏時間的延長，對照和ASM處理蘋果果實PPO活性均表現出上升趨勢，且ASM處理果實中PPO活性始終高于對照組，并且在貯藏第6天到第12天差異顯著（P<0.05）。已有研究表明，采后ASM處理顯著提高了低溫貯藏藍莓果實中的PPO活性，并且提高了果實的抗氧化能力[20]。由此說明，ASM處理通過誘導PPO活性的升高來提高果實的抗氧化能力。

2.3 ASM處理對果實4CL活性的影響

ASM處理對果實4CL活性的影響見圖3。

圖3 采后ASM浸泡處理對蘋果果實4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL）活性的影響Fig.3 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the activity of 4CL of apple fruit

在苯丙烷代謝途徑中，4 CL處于總途徑向分支途徑進行生物合成的轉折點，可催化各種羥基肉桂酸生成相應的硫酯，從而進入木質素合成途徑形成香豆酸、阿魏酸和咖啡酸，也可進入酚類和類黃酮、花色苷物質的合成途徑[23]。由圖3可知，在整個貯藏期間，對照和ASM處理果實4CL活性整體呈先上升再下降的趨勢。ASM處理使果實4CL活性高峰的出現提前，而對照果實的4CL活性高峰不明顯，并且ASM處理果實4 CL活性在整個貯藏期間均高于對照果實。藍莓[20]、甜瓜[11]等果實中的研究也得到了類似的結果。

2.4 ASM處理對果實C4H活性的影響

ASM處理對果實C4H活性的影響見圖4。

圖4 采后ASM浸泡處理對蘋果果實肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）活性的影響Fig.4 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the activity of C4H of apple fruit

C4H是苯丙烷代謝的第二關鍵酶，與果實體內咖啡酸和阿魏酸等物質的合成前體p-香豆酸的合成密切相關，這些酚酸可以直接毒殺病原物[18]。由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，對照蘋果果實C4H活性整體呈先升高后降低的趨勢，但ASM處理顯著提高了果實C4H活性，并且出現了雙峰變化趨勢。

2.5 ASM處理對果實總酚和類黃酮含量的影響

ASM處理對果實總酚和類黃酮含量的影響見圖5和圖6。

圖5 采后ASM浸泡處理對蘋果果實總酚含量的影響Fig.5 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the content of total phenolic compounds of apple fruit

圖6 采后ASM浸泡處理對蘋果果實類黃酮含量的影響Fig.6 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the content of flavonoids of apple fruit

酚類和類黃酮是苯丙烷類代謝途徑的最終產物，本身具有直接的抑菌作用，同時酚類物質又是合成木質素的前體，促進細胞壁結構的強化[24]。類黃酮能夠直接抑制真菌孢子萌發、菌絲生長和芽管伸長[25]。由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，對照和ASM處理果實總酚含量逐漸升高，但二者沒有顯著的差異。對照和ASM處理果實類黃酮含量在貯藏第0天到第6天差異不大，但在后期ASM處理顯著提高了果實類黃酮含量，并且在第10天出現高峰。已有研究表明，采前或采后 ASM 處理能夠促進藍莓[20]、甜瓜[11]、鴨梨[19]、芒果[26]等果實體內總酚和類黃酮等抗性物質的積累，從而提高果實的抗病性。此外，采后多聚賴氨酸處理也誘導了蘋果果實PAL活性的升高[21]。由此說明，采后ASM處理通過激活苯丙烷代謝關鍵酶活性促進次生代謝產物的積累，從而提高果實的抗病性。

3 結論

采后ASM能夠通過提高蘋果果實苯丙烷代謝關鍵酶PAL、4CL、C4H的活性，促進抗性物質總酚和類黃酮的積累，還能夠提高PPO活性從而提高醌類物質的生成，由此強化細胞壁結構，增強果實的抗氧化和抗病能力，最終達到延長果實貯藏期的作用。