8種食用菌粗黃酮的萃取及其抗氧化活性研究

范俐，姜咸彪，許禎毅

（武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建 南平 354300）

食用菌營養(yǎng)豐富、味道鮮美，被稱為“山珍”與“優(yōu)質(zhì)食品的頂峰”，含有多種生理活性物質(zhì)，具有重要食療保健功能。黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗衰老、抗疲勞、抗菌、抗病毒、抗過敏、增強(qiáng)免疫機(jī)能、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與內(nèi)分泌等諸多功效[1-2]。越來越多的研究表明，天然黃酮不僅存在于植物體內(nèi)，也存在食用菌子實(shí)體中[3-6]。食用菌黃酮的提取方法主要有超聲波醇提法、超臨界CO2萃取法、微波提取法、復(fù)合酶法和溶劑浸提法等。超聲波乙醇浸提法（下文簡稱超聲波醇提法）具有操作簡便、時間短、效率高、節(jié)能等特點(diǎn)，是目前使用最多的方法之一。

模擬消化法是在體外模擬人體胃腸消化分解食物的過程，常用于研究食物消化率、食物營養(yǎng)價值和消化酶的復(fù)合篩選的方法。近年來，采用模擬消化法萃取分析食物中活性物質(zhì)及其抗氧化性的文獻(xiàn)報道日益增多。Tarko T等研究發(fā)現(xiàn)在低pH值胃酸條件下，黃酮類低聚物降解成更小的單元；在小腸中，黃酮可能會發(fā)生去糖基化、葡萄糖醛酸化、甲基化、磺化和類黃酮羥基化等生化變化[7]；兒茶素沒食子酸酯在經(jīng)腸道消化后對清除自由基、螯合鐵離子更為有效；消化酶和胃酸均可以促進(jìn)抗氧化活性物質(zhì)的釋放，黑脈羊肚菌模擬消化后的抗氧化作用和抗癌細(xì)胞增殖活性均有提高[8]。

本研究以8種食用菌為材料，采用模擬消化法與超聲波醇提法提取粗黃酮，比較兩種方法對粗黃酮含量、還原力、清除羥自由基能力的不同影響，為食用菌保健價值及資源的深度開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇（Lentinus edodes）、姬松茸（Agaricus blazei）、黑木耳 （Auricularia auricula）、銀耳 （Tremella fuciformis）、紅菇（Russula Vinosa）、梨紅菇（Russula cyanoxantha）、黃牛肝（Boletinus auripes）和竹蓀（Dictyophora indusiata）等8種食用菌：南平市建陽菇乃乃有限公司，60℃烘干12 h后，用高速粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，裝入密封袋備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、鐵氰化鉀、硫氰酸鉀、三氯乙酸、氫氧化鈉、氯化鈉、亞硝酸鈉：上海展云化工有限公司；牛膽粉、淀粉酶（10 U/mg）、胃蛋白酶（30 000 U/g）、胰酶（胰脂肪酶 2 500 U/g、胰蛋白酶500 U/g、胰淀粉酶6 700 U/g）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；硝酸鋁、磷酸二氫鉀、檸檬酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全溫培養(yǎng)搖床（QYC-200）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)（Neofug e23R）：上海力申科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-6100）：上海元析儀器有限公司；小型高速粉碎機(jī)（6202）：欣鎮(zhèn)精密企業(yè)有限公司；微量有機(jī)純水機(jī)（WP-UP-UV-20）：四川沃特爾科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗機(jī)（SB-25-12DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-D-III）：河南省予華儀器有限責(zé)任公司；電子天平（FA224）：舜宇恒平儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：金壇市鴻科儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9076A）：上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；移液器（Pipet-Life XLS+）：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波醇提法

參考陳新華[9]的方法制備食用菌粗黃酮提取液，具體操作：稱取粉碎的食用菌樣品2.00g置于50mL容量瓶中，加入40 mL 80%乙醇溶液，浸泡24 h，超聲波輔助提取1 h，上清液用80%乙醇溶液定容至250 mL，測定粗黃酮提取率后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用80%酒精配制系列梯度濃度粗黃酮溶液，用于抗氧化試驗。

1.3.2 模擬消化法

參考中國藥典[10]、劉國艷等[11]、HOU F L 等[12]方法，略作修改。

人工唾液配制：氯化鈉0.126 g、氯化鉀0.964 g、硫氰酸鉀0.189 g、磷酸二氫鉀0.655 g、淀粉酶0.2 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)至pH6.8。

人工胃液配制：取稀鹽酸1.64 mL（相當(dāng)于鹽酸0.381 mL），加蒸餾水80 mL與1 g胃蛋白酶，搖勻后，加蒸餾水定容至100 mL，調(diào)至pH1.2。

人工腸液配制：取磷酸二氫鉀3.4 g，加水250 mL溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH6.8；另取胰酶5 g，膽粉15 g，加水適量使之溶解；將兩液混合后，加水稀釋到500 mL，調(diào)至pH 6.8。

模擬消化過程：稱取2.00g食用菌樣品，加入20mL人工唾液，為試驗組；不加樣品為對照組。于37℃，100 r/min的恒溫?fù)u床中消化30 min。將試驗組與對照組，用1 mol/L HCl溶液調(diào)至pH 2.0，分別加入4 mL人工胃液，于37℃，100 r/min的恒溫?fù)u床中消化60 min。再用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，將試驗組與對照組調(diào)至pH6.8，分別加入16 mL人工腸液，于37℃，100 r/min的恒溫?fù)u床中消化120 min。最后，取樣品置于碎冰冷卻，經(jīng)20 000 r/min離心20 min后，取上清液，殘渣過濾液匯總一起，測定容積，放于冰箱備用，測定粗黃酮釋放量。再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用80%酒精配制系列梯度濃度粗黃酮溶液用于抗氧化活性測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與粗黃酮含量測定

按照王廣慧等[13]方法，分別量取0.10 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 于 10.00 mL容量瓶中，加入0.30 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min；加入0.30 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min；然后加入4.00 mL的4%氫氧化鈉溶液，用70%的乙醇定容到刻度，搖勻，靜置15 min，在510 nm波長處測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），得線性回歸方程y=1.211 1x-0.002，R2=0.999 7。按照同樣方法測定8種食用菌樣品粗黃酮提取液，做3組平行試驗，所得的吸光度帶入回歸方程，計算出樣品粗黃酮濃度（mg/mL）和粗黃酮含量，計算公式如下。

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的樣品粗黃酮濃度，mg/mL；V為待測樣品溶液體積，mL；N為樣品的稀釋倍數(shù)；M為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 還原能力的測定

參照孫維蔓等[14]方法，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮各樣品粗黃酮提取液，再配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL系列濃度待測。待測液用蒸餾水定容到1 mL，然后加入pH6.6磷酸鹽緩沖液2.5 mL、1%鐵氰化鉀2.5 mL，50℃水浴20min，再加入10%三氯乙酸1mL，隨后5 000 r/min離心10 min，吸取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5mL，0.1%的三氯化鐵0.5mL混勻，于700 nm處測定吸光度，每個樣品平行測定3次，以VC作為對照。

1.3.5 羥自由基清除率的測定

參照 HUANG X[15]水楊酸法，配制 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL系列樣品待測，待測液加入9 mmol/L硫酸亞鐵1mL，9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL和9mmol/L過氧化氫1 mL，在37℃水浴反應(yīng)30 min，在512 nm下測吸光度，每個樣品平行測定3次，計算羥自由基清除率，以VC作為對照。

式中：A0為用蒸餾水代替樣品的吸光值；A1為樣品吸光值；A2為用蒸餾水代替H2O2的吸光值。

1.3.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)和進(jìn)行配對樣本T檢驗、單因素方差分析、相關(guān)性分析，試驗結(jié)果均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SD）；采用 SPSS 19.0軟件中分析→回歸→Probit獲得EC90、EC50的模型，部分模型采用曲線回歸分析。采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法萃取食用菌粗黃酮含量的比較

模擬消化法與超聲波醇提法提取8種食用菌粗黃酮含量比較見表1。

由表1可知，采用體外模擬消化法提取食用菌粗黃酮的含量顯著高于超聲波醇提法，體外模擬消化法提取8種食用菌粗黃酮含量為1.25 mg/g ～7.85 mg/g，而超聲波醇提法為0.45 mg/g ～5.26 mg/g，體外模擬消化法粗黃酮提取率比超聲波醇提法高出20.33% ～509.62%。梨菇、銀耳、紅菇分別高出509.62%、479.69%和307.92%；而姬松茸與竹蓀分別僅高出47.27%、20.33%。通過配對樣本T檢驗，兩種方法存在極顯著正相關(guān)，表明采用體外模擬消化法提取食用菌粗黃酮含量，極顯著高于超聲波醇提法。

表1 模擬消化法與超聲波醇提法提取8種食用菌粗黃酮含量比較Table1 Comparisons of crude flavonoids yield in 8 edible fungi extracted by simulated digestion and ultrasonic alcohol extraction

8種不同食用菌粗黃酮的含量差異也同樣顯著（P＜0.01），兩種方法提取液中粗黃酮含量最高均為黃牛肝，最小均為黑木耳。

2.2 兩種方法萃取食用菌粗黃酮抗氧化活性比較

2.2.1 羥自由基清除能力的比較

8種食用菌粗黃酮對羥自由基的消除作用見圖1，模擬消化法與超聲波醇提法提取8種食用菌粗黃酮對羥自由基消除作用的90%最大效應(yīng)濃度（concentration for 90% of maximal effect，EC90）比較見表 2。

由圖1可見，相同濃度的粗黃酮溶液進(jìn)行比較，模擬消化法提取的粗黃酮，其羥自由基清除能力強(qiáng)于超聲波醇提法，羥自由基清除率隨著粗黃酮濃度的增加而升高。由表2可見，8種食用菌粗黃酮羥自由基清除EC90比較，模擬消化法提取的粗黃酮清除羥自由基能力比超聲波醇提法高出33.64% ～3 216.67%，按大小排序為：黑木耳＞銀耳＞竹蓀＞黃牛肝＞梨菇＞香菇＞紅菇＞姬松茸。

2.2.2 還原能力的比較

8種食用菌粗黃酮還原力的比較見圖2，模擬消化法與超聲波醇提法提取8種食用菌粗黃酮的還原力EC50比較見表3。

圖1 8種食用菌粗黃酮對羥自由基的清除作用Fig.1 Scavenging activity to hydroxyl radical of crude flavonoids from 8 edible fungi

表2 模擬消化法與超聲波醇提法提取8種食用菌粗黃酮對羥自由基清除作用的EC90比較Table 2 Comparisons of EC90 scavenging activity to hydroxyl radical of 8 crude flavonoids extracted from edible fungi by in simulated digestion and ultrasonic alcohol extraction

表3 模擬消化法與超聲波醇提法提取8種食用菌粗黃酮的還原力EC50比較Table 3 Comparisons of reducing power EC50 of 8 crude flavonoids extracted from edible fungi by simulated digestion and ultrasonic alcohol extraction

圖2 8種食用菌粗黃酮還原力的比較Fig.2 Comparisons of the reducing power of crude flavonoids from 8 edible fungi

由圖2可見，相同濃度的粗黃酮溶液進(jìn)行比較，兩種方法萃取的粗黃酮吸光值隨著濃度的增加而升高，說明8種食用菌粗黃酮還原能力隨著濃度增加而加強(qiáng)。由表3可見，體外模擬消化法提取8種食用菌粗黃酮還原力EC50與超聲波醇提法比較，除了黃牛肝降低了43.47%，其余7種食用菌粗黃酮還原力EC50均高于超聲波醇提法，增加幅度為19.87% ～151.76%，增加幅度最大的分別為姬松茸、銀耳與紅菇。按幅度大小排序為：竹蓀＞姬松茸＞銀耳＞梨菇＞紅菇＞香菇＞黑木耳＞黃牛肝，其中竹蓀、姬松茸、銀耳的粗黃酮還原力EC50增加幅度分別為151.76%、147.10%和61.46%。

3 討論與結(jié)論

采用模擬消化法萃取8種食用菌子實(shí)體的粗黃酮，萃取液中粗黃酮的含量均顯著高于超聲波醇提法，增加幅度為20.3% ～509.6%。表明模擬消化過程中，在多種消化酶、胃酸、膽鹽的作用下，能夠更多釋放食用菌子實(shí)體中黃酮類物質(zhì)。主要原因可能是：1）在胃蛋白酶、胰蛋白酶的作用下，將結(jié)合或包圍于黃酮外部的蛋白質(zhì)水解為小分子多肽，使結(jié)合態(tài)黃酮轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，從細(xì)胞壁中分離釋放，Li Qian等[15]和Tarko等[7]的研究中也得到了類似的結(jié)果；2）黃酮大部分以氫鍵和疏水鍵等非共價鍵與多糖（如纖維素、半纖維素）結(jié)合，胃酸屬于強(qiáng)酸環(huán)境，破壞了氫鍵的穩(wěn)定性，降低了分子之間的作用力[16]，從而使黃酮物質(zhì)釋放；3）黃酮通常與多糖或有機(jī)酸連接，結(jié)合于細(xì)胞的不同組分中，在唾液淀粉酶、胰淀粉酶作用下斷裂，促進(jìn)黃酮物質(zhì)釋放；4）模擬消化過程可以降低食糜的粒徑，有利于黃酮的釋放；5）在胃液作用下，部分多聚類黃酮或寡聚類黃酮水解為類黃酮單體[17-18]。模擬消化法可以促進(jìn)多酚的釋放，從彥麗等[19]、趙旭等[20]和封易成等[21]的研究也得到了類似的結(jié)果。黃酮苷酸解為黃酮苷元見圖3。

圖3 黃酮苷酸解為黃酮苷元Fig.3 Flavonoid glycosides acid hydrolysis to flavonoid aglycones

模擬消化法萃取粗黃酮的抗氧化活性也顯著高于超聲波醇提法。將兩種方法萃取獲得的粗黃酮，配制成相同濃度梯度溶液進(jìn)行抗氧化活性比較，模擬消化法自由基清除能力EC90高于超聲波醇提法33.64% ～3 216.67%，還原力EC50高出19.87% ～151.76%。主要原因可能是：1）在胃酸作用下，黃酮苷類部分被酸解去糖基化，轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)黃酮苷元或形成更小糖基的黃酮苷[22]，具有更強(qiáng)的清除氧自由基能力，黃酮苷元效價是黃酮糖苷的7倍[23]；2）部分黃酮糖苷的糖基為多糖，在唾液淀粉酶、胰淀粉酶作用下斷裂，形成糖基更小而抗氧化更強(qiáng)的黃酮苷，這一結(jié)果在劉亞男、Baublis等的研究中也得到證實(shí)[24-26]。抗氧化活性大小順序為黃酮苷元＞黃酮糖苷>黃酮二糖苷＞黃酮四糖苷。超聲波醇提法采用80%乙醇溶劑，萃取物主要為黃酮苷類，沒有發(fā)生類似生化反應(yīng)；3）體外消化使黃酮物質(zhì)存在形式發(fā)生改變，不同活性物質(zhì)之間發(fā)生協(xié)同作用，使抗氧化活性增加[27]；盛雪飛[28]研究6種黃酮單體的抗氧化協(xié)作效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)槲皮素和蘆丁具有較高的抗氧化性，與其他黃酮單體組合時，具有協(xié)同增效作用；4）人工消化液和膽鹽含有金屬離子與黃酮的螯合反應(yīng)，提高抗氧化活性。另外，萃取溶劑不同，提取的除黃酮之外的物質(zhì)成分有所不同，模擬消化的是水提物，含有多糖和黃酮苷，而超聲法的是醇提物，提取的醇溶物不含多糖和黃酮苷，兩種不同的萃取溶劑也可能成為抗氧化活性不同的原因之一。

模擬消化法較真實(shí)地模擬了食物在人體內(nèi)消化過程中的pH值和酶環(huán)境，一些抗氧化物質(zhì)（如黃酮）在胃腸道可能會發(fā)生各種生化反應(yīng)，影響其生物生理活性，傳統(tǒng)的化學(xué)萃取法無法真實(shí)反映黃酮在消化道中的存在形式和抗氧化能力。因此，模擬消化法對食用菌黃酮及其抗氧化活性的評價更科學(xué)合理。但是，人體消化道是一個復(fù)雜體系，涉及諸多因素，如何進(jìn)一步純化食用菌黃酮化合物，更準(zhǔn)確評價其活性功能，有待于深入研究。